201906. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy fenil-karbamát-származék és savaddíciós sói és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 201 906 B 2 A találmány tárgya eljárás új, antikolinészteráz hatású fenil-karbamát-származék és e vegyületet tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására. Közelebbről a találmány tárgya eljárás az (I) képlett! (S)-N-etil-3-[l-(dimetil-amino)-etiI]-N-metil-fenil-karbamát előállítására szabad bázis vagy annak valamilyen savaddíciós sója alakjában. A képlet mutatja, hogy a szabad bázis optikai forgatása a (-)-előjelnek megfelelő; savaddíciós sók alakjában azonban az előjel akár (+), akár (-) lehet. így például a hidrogén-tartarát-só forgatása a (+)-előjelnek megfelelő. A találmány szerinti eljárás - a forgatás irányától függetlenül - mind a bázisformára, mind a savaddíciós sók előállítására vonatkozik, és egyaránt elvégezhető bázis vagy savaddíciós só alakú kiindulási vcgyülettel. A (+)-N-ctil-3-[l-(dimetil-amino)-etil]-N-metil-fenil-karbamát racém keveréket hidrokloridja alakjában ismerteti a 0 193 926 számú európai közrebocsátási irat, ahol ezt a racemátot RA7 HCl-nek jelölik. E közrebocsátási irat szerint a szabad bázis racemátját úgy állítják elő, hogy (x-(m-hidroxi-fenil)-etil-dimetilamint a megfelelő karbamoil-halogeniddcl reagáltatnak. Az így kapott vegyület és annak gyógyászati szempontból elfogadható savaddíciós sói - amelyek a szabad bázisból ismert módon készíthetők - a központi idegrendszerben acetil-kolinészteráz-gátló hatást fejtenek ki. Meglepő módon azt találtuk, hogy az (I) képletű vegyület (-)-enantiomerje és annak gyógyászati szempontból elfogadható savaddíciós sói (e vegyületeket a továbbiakban esetenként találmány szerinti vagy (I) képletű vegyületcknek nevezzük) különösen jelentős és szelektív acetil-kolinészterázgátló hatással rendelkeznek. E felismerésünk nem volt várható, különösen azért nem, mert nem állítható, hogy a dialkil-amino-alkil-oldallánc - amely az optikailag aktív szénatomot tartalmazza - elsősorban felelős a fenil-karbamát-származékok kolinészterázgátló hatásáért. A találmány szerinti vegyületeket mindeddig nem írták le konkrétan az irodalomban. A találmány szerinti vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy a racemátot egy savval - például di-(0,0’-p-toluil)-borkősavval reagáltatjuk, majd az (I) képletű vegyület így kapott savaddíciós sóját frakciónál! kristályosítással elkülönítjük. A savaddíciós sótól a szabad bázist ismert módon, lúggal való kezelés útján állíthatjuk elő. A találmány szerinti vegyületek standard vizsgálati módszerekkel igazolható farmakológiai hatással rendelkeznek, s így gyógyászatilag alkalmazhatók. Patkányokban - mind szubkután, mind intraperitoneális vagy orális adagolás útján - könnyen bejutnak a központi idegrendszerbe, ahol az agyterület szempontjából szelektíven gátolják az acetil-kolinészteráz enzimet: a hippocampusban és az agykéregben jelenlévő enzimet erősebben gátolják, mint a csikóit testből (corpus striatumból) vagy az agyhídból vagy a velőből (medullából) származó enzimet. A találmány szerinti vegyületek enzimgátló hatása tartós. Az alábbiakban közölt eredmények bemutatják a találmány szerinti vegyületek farmakológiai profilját a megfelelő izomerekkel és racemátokkal összehasonlítva. Az alábbiakban az „A” vegyület az (I) képletű vegyület hidrogén-tartarátja; a „B” vegyület az előbbi só optikai izomerje; „C”-vel jelöljük az (I) képletű vegyületből és optikai izomerjéből álló racém keveréket hidrokloridja alakjában. In vitro vizsgálatok 3H-Acetil-kolin felszabadulása patkány-hippocampusszeletekből elektromos ingerlés hatására A patkányok hippocampus-szeleteiből elektromos úton kiváltott 3H-acetil-kolin (3H-ACh) felszabadulás funkcionális in vitro kísérleti modell preszinaplikus muszkarin-autoreceptor-agonisták és -antagonisták vizsgálatára. Ez a modell felhasználható továbbá közvetett módszerként olyan hatóanyagok kiértékelésére, amelyek az acetilkolinészteráz (AChE) enzimet gátolják. Az AChE enzim aktivitásának gátlása előidézi az endogén acetil-kolin (ACh) felhalmozódását, amely azután kölcsönhatásba lép a preszinaptikus muszkarin-autoreceptorokkal, s így a 3H-ACh további felszabadulását gátolja. Wistar-törzsű, 180-200 g testtömegű patkányok hippocampusából szeleteket készítettünk úgy, hogy keresztmetszet irányában 0,3 mm vastagságú szeleteket vágtunk egy Mcllwain-lípusú szövetszeletelő eszközzel. Az így kapott, 3 patkányból származó hippocampus-szelctcket 30 percig 23 'C hőmérsékleten 6 ml olyan Krebs-Ringer oldatban inkubáltuk, amely 0,5 pCi 3H- kolint tartalmazott, majd átvittük a szuperfúziós kamrába, és szuperfúziót végeztünk olyan Krebs-közeggel, amely 10 pM hemikolinium-3 anyagot tartalmazott. A szuperfúziót 30 °C-on, 1,2 ml/perc sebességgel végeztük. A szuperfúzióból 5 percenként összegyűjtött frakciók gyűjtését a szuperfúzió kezdete után 60 perccel indítottuk. Az elektromos ingerlést (2 Hz, derékszögű, 2 msec időtartamú, 10 mA erősségű, 2 percen át tartó) két periódusban végeztük, egyrészt 70 perccel (S0, másrészt 125 perccel (SO a szuperfúzió megkezdése után. A vizsgálandó anyagokat az S2 időpont előu 30 perccel adtuk a szuperfúziós közeghez, amelyben a szuperfúzió 145. percéig voltak jelen. A kísérletek végén a szeleteket tömény hangyasavban szolubilizáltuk, és a szolubilizált szeletek szuperfuzátumában meghatároztuk a tríciumtartalmat. A trícium kiáramlását a trícium percenkénti kiáramlásában megadott sebességként fejeztük ki. A trícium elektromos úton kiváltott kiáramlását úgy számítottuk ki, hogy a 2 percig tartó elektromos ingerlés és az azt követő 13 perc alatti teljes trícium-kiáramlásból kivontuk a trícium-kiáramlás extrapolált alapértékét, és ezt a mintagyűjtés megkezdésekor jelenlévő trícium-tartalom százalékos értékében fejeztük ki. A hatóanyagoknak az ingerléssel kiváltott trícium-kiáramlásra gyakorolt hatását az S/Si viszonyszámmal fejeztük ki. összes kísérleteinket ismétléssel, programozható, 12-csatomás szuperfúziós rendszer segítségével végeztük. A számítás céljára számítógépes programot alkalmaztunk. E vizsgálatok során az „A” vegyület a hippocampusszeletekből elektromos ingerléssel kiváltott 3H-ACh felszabadulást megközelítőleg 40%-kal gátolta (100 pM); a „C” jelű racemát (100 pM) ezt a kiáramlást megközelítőleg 25%-ban gátolta. Az "A” vegyület és a „C” racemát gátló hatása atropinnal antagonizálható volt. Ezek az eredményeink az AChE-gátló hatással összeegyeztethetők. A "B” vegyület ezen a kísérleti modellen hatástalan. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
