201874. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új, biológiailag aktív hatóanyag, és ezt az anyagot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 201874 B 2 és víz 7:3 térfogatarányú elegyével végezzük, majd ezt követően Sephasorb HP és Sephadex LH-20 töltetű oszlopokat használunk, és metanollal eluálunk. A biológiailag aktív anyagot az alábbi eljárással is extrahálhatjuk és tisztíthatjuk 1. típusú humán női emlőciszta-folyadékból. Az ionösszetétel meghatározása után az 1. típusú humán női emlőciszta-folyadékot közvetlenül frakcionáljuk, csökkenő ionos polaritású szerves oldószerek két egymást követő hozzáadásával, a fent ismertetett módon. így azonban kiiktatjuk a fenti rövidszénláncú alkohollal végzett extrakciós lépést. A fenti módon frakcionált biológiailag aktív anyagot ezután sorozatos kromatográfiás eljárással tisztítjuk, hidrofób affinitási kromatográfiás oszlopot - például Sephadex LH-20-at majd amino-szénhidrát oszlopot használva. A fenti extrakciós és tisztítási eljárást az 5. példával szemléltetjük. A fenti frakcionálás és kromatográfiás tisztítási eljárás előnyei az alábbiakban foglalhatók össze:- kényelmes,- gyors (a teljes tisztítás 1-2 nap alatt végrehajtható),- egyszerű (csak 2 oszlopkromatográfiás lépés kell 3 vagy 4 helyett), és- a végtermék tisztasága fokozódik. Az utóbbi bizonyítéka, hogy a 8. ábrán csak anyagcsúcs látható, amely 210 nm-nél abszorbeálja a fényt, ha a frakciókat kromatográfiásan újraanalizáljuk. A 210 nm-nél mutatkozó fényabszorpció a találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag másik jellemző tulajdonsága, a digoxinnal szembeni antitestekkel való kapcsolódás mellett. A találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag azon képessége alapján azonosítható, hogy keresztakciót ad a digoxinnal szembei antitestekkel. A fenti antitestek a kereskedelmi forgalomban kaphatók (New England Nuclear, Boston, MA, katalógusszám: A082). A találmány szerinti biológiailag aktív anyag jelenlétének kimutatására a Clinical Assays (Cambridge, MA, USA katalógusszám: 527) által előállított, digoxinnal szembeni antitestet is használhatjuk. A találmány szerinti biológiailag aktív anyag kimutatására az ismeretlen oldathoz meghatározott mennyiségű antitestet és radioaktívan jelzett digoxint adtunk. Az antitest megkötődésére elegendő idő elteltével a kötött és kötetlen anyagot centrifugálással szétválaszjuk. A biológiailag aktív anyag jelenlétét az ismeretlen oldatban szcintillációs számlálóberendezésben határozzuk meg, a kötött frakcióban. A találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag mennyiségét ng digoxin egyenértékben fejezzük ki. 1 ng digoxin egyenérték alatt a találmány szerinti biológiailag aktív anyag azon mennyiségét értjük, amely ebben a vizsgálatban 1 ng digoxinnal kapható biológiai kiválasztáshoz szükséges. A fenti vizsgálatot részletesen a 2. példában ismertetjük. A találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag tulajdonságai alapján - például kromatográfiás viselkedése és emésztési termékei alapján- feltehetőleg egy szteroid- konjugátum. Az 1. típusú humán női emlőciszta-folyadékból származó biológiailag aktív anyag emlős szervezetekben erősen csökkkenti a vérnyomást. A találmány szerinti biológiailag aktív anyag adagolására egészséges emlős állatok vérnyomása a kezdeti (adagolást megelőző) értéknek még 45%-ára is csökkenhet. A találmány szerinti eljárással előállított, tisztított biológiailag aktív anyag egyedi és váratlan tulajdonságokat mutat. A biológiailag aktív anyag stimulálja a Na+, K+-ATPáz enzimet, míg a szív-gükozid digoxin és digitális gátolja ennek az enzimnek az aktivitását. A Na+, K+- ATPáz enzim enyhe diuretikus aktivitással rendelkezik, amelynek jelentősége lehet a vérnyomáscsökkentő aktivitás szempontjából a betegek számára. Ezért az 1. típusú humán női emlőciszta-folyadékból izolált biológiailag aktív anyag állatokban olyan betegségek kezelésére, alkalmazható, amikor a nátrium-egyensúly megbomlik, ilyen például a spontán ödéma. Ezenkívül kimutattuk, hogy a találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag stimulálja az ouabain kötődését annak celluláris receptoraihoz (lásd 6. példa). Ez a Na+, K+-ATPáz rendszerre ható biológiailag aktív anyagnak a legmeglepőbb tulajdonsága, ugyanis a találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag stimulálja a Na+, K+-ATPáz aktivitást, és ennek alapján azt vártuk volna, hogy gátolja az ouabain kötődését a saját receptoraihoz. Azonban a találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag növeli a receptorokhoz kötődő ouabain mennyiségét, előre nem várt módon. Nem tudunk egyetlen más anyagról sem, amely ilyen tulajdonsággal rendelkezne. Az 1. típusú humán női emlőciszta-folyadékból izolált hatóanyag egy endogén vérnyomáscsökkentő faktor. E tulajdonsága következtében várható, hogy az ilyen tulajdonságú anyag nemcsak olyan betegségek kezelésére lesz alkalmas, amelyeket jelenleg digitálissal, vagy digoxinnal vagy ouabainnal gyógyítanak, hanem általános vérnyomáscsökkentő szerként is alkalmazható. Ezenkívül várható, hogy a találmány szerinti eljárással előállított hatóanyag ouabainnal együtt alkalmazva növeli az ouabain hatékonyságát, és ezáltal annak felhasználhatóságát. Emlősök magas vérnyomásának csökkentésére a találmány szerinti eljárással előállított biológiailag aktív anyag dózisa a betegség súlyosságától, és a kezelendő alany állapotától és egyedi tulajdonságaitól függően változik. Emlősökben a magas vérnyomás, pangásos szívbetegségek, vagy szívpitvari fibrilláció kezelésére a készítményt várhatóan általában kb. 10 ng digoxin-ekvivalens és kb. 1000 ng digoxin ekvivalens közöti mennyiségben alkalmazzuk testtömeg kilogrammonként, naponta. Hasonló dózisokat és dózis-tartományokat alkalmazhatunk spontán ödéma, vagy más, nátrium-egyensúly felbomlásával járó betegségek kezelésére is. A találmány szerinti eljárással előállított új hatóanyagot parenterálisan (ez az előnyös alkalmazás), és orálisan, intranazálisan vagy tmaszdermálisan is alkalmazhatjuk, gyógyászati készítmények formájában, amelyeket ismert módon állíthatunk elő. A parenterális alkalmazásra szánt készítmények például a hatóanyag vizes oldatát izotóniás sóoldatban, 5%-os glükózoldatban vagy egyéb szokásos, gyógyászatiig elfogadható folyadékban tartalmazzák. A találmány szerinti eljárással előállított hatóanyagot orális adagolásra alkalmas gyógyászati készítménnyé is formálhatjuk. A hatóanyagot folyékony for5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
