201844. lajstromszámú szabadalom • Immunadszorpciós-amidolitikus módszer a humán vizelet-plazminogén aktivátor prekurzor ( pro-uPA) és a humán vizelet -plazminogén aktivátor (u-PA) meghatározására
HU 201844 B szöveti típusú PA-tól. Az aktív hely a pro-uPA-ban rejtettnek tűnik, mivel nem figyelhető meg [^DFPf -diizopropilfluoro-foszfát) inkorporádó, sem pedig benzamidin-agarózhoz való kötődés. Ez a pro-uPA továbbá inaktív az S2444-es szintetikus szubsztráton, a plazmin kezelés azonban az u-PA-hoz hasonló, kettős láncú aktív formává (150.000 NE/mg) alakítja át. Ez az aktivált forma a H-DFP-t a 31500-as nehéz láncba inkorporálja, és a benzamidin-agarózhoz kötődik. Az A431-es sejtekből a fentiek szerint tisztított pro-uPA amino-terminális szekvenciája (26 aminosav) azonosnak bizonyult a vese-sejtekből izolált pro-uPA-val (J. Bioi. Chem. 22, 12383-12389 /1985/). & készítmény A mikrolemezek bevonása 5B4-gyel Poli-vinil-klorid mikrolemezek (Falcon Microtest m-as rugalmas vizsgálati lemez; Becton Dickinson and Co., USA), valamennyi vájatát 0,15 M nátrium-kloridban és 0,05 MpH= 73-as nátriumfoszfát pufferben (PBS) oldott 35 pg/ml-es 5B4 oldat 200 pj-ével töltöttük meg. Két órán keresztül szobahőmérsékleten, zárt dobozban végzett inkubálás után a mikrolemezeket 5-ször átmostuk oly módon, hogy kiürítettük és PBS-sel töltöttük meg őket. Ezután mindegyik vájathoz PBS-ben oldott 10 gű-es vodn szérum albumin (BSA) 250 pi-ét adtuk, és szobahőmérsékleten 2 órán keresztül állni hagytuk, a be nem vont felület blokkolása céljából. Ezután a lemezeket ismét átmostuk PBS-sel, rázással szárítottuk és 4 °C-on tároltuk a felhasználásig. Lényegében ugyanezen eljárást követve, de a 2. készítménynél leírtak szerint előállított, hagyományos antiszérum felhasználásával antiszérummal bevont, az 1. példa szerinti eljárásban alkalmazható mikrolemezt kaptunk. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás humán vizelet-plazminogén aktivátor nak (u-PA), zimogénjének (humán vizelet-lazminogén aktivátor prekurzor, pro-uPA) vagy ezek keverékének meghatározására, azzal jellemezve, hogy (i) a vizsgálandó oldatot egy analitikai segédanyaggal hozzuk érintkezésbe, amelynek felülete a következő tulajdonságokkal jellemezhető monoklonális antitesttel van bevonva:- az IgGi osztályba tartozik,- az antigénhez 10-6—10'11 affinitású,- specifikusan kötődik a nagymolekulatömegű (54000 D) u-PA-hoz, illetve annak prekurzorához (azaz a pro-uPA-hoz) anélkül, hogy megkötné a kismolekulatömegű (33000 D) formát),- anélkül, hogy kötődne a szérumban vagy a vizeletben lévő endopeptidázokhoz,- anélkül, hogy gátolná az u-PA enzimes aktivitását, illetve a pro-uPA enzimes aktiválását,- izoelektromos pontja 5,5 és 6 között van, (ii) pufferes öblítést követően a kezelt analitikai segédanyagok egyik sorozatához valamilyen enzi-19 matikus aktivátor pufferes oldatát adjuk, ugyanakkor ezzel párhuzamosan a kezelt analitikai segédanyagok egy másik sorozatához csak a pufferoldatot adjuk; (iii) az így kapott oldatok koncentrációját az önmagában ismert amidolitikus módszer szerint határozzuk meg szintetikus szín-előhívó szubsztráton, standard görbéhez viszonyítva; az u-PA koncentrációját közvetlenül azon mintákból határozzuk meg, amelyeket az (ii) lépésben nem kezeltünk az enzimatikus aktivátorral, míg a pro-uPA koncentrációját az enzimatikus aktivátorral kezelt, illetve csak a pufferrel kezelt mintákban mért vizsgált anyag koncentrációinak különbsége alapján határozzuk meg. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy műanyagból készült analitikai segédanyagot alkalmazunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy műanyag mikrotiteres lemezek, kémcsövek vagy lemezek, illetve nitrocellulóz vagy nylon membránok közül kiválasztott analitikai segédanyagot alkalmazunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polisztirol, poli-vinilk-klorid vagy polietilén mikrotiteres lemez analitikai segédanyagot alkalmazunk. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan analitikai segédanyagot alkalmazunk, mely a következő tulajdonságokkal jellemezhető monoklonális antitesttel van bevonva:- az IgGi osztályba tartozik,,- affinitási állandója l,42xl071/mól, előnyösen a Tsapis és munkatársai által leírt módszerrel (Eur. J. Biochem. 64,369 /1976/) mérve;- specifikusan köti az u-PA nagy molekulatömegű (54000 D) formáját, illetve annak prekurzorát (azaz a pro-uPA-t) anélkül, hogy megkötné a kis molekulatömegű (33000 D) formát, illetve az u-PA — szérumban vagy vizeletben lévő—tromboplasztin szennyeződését;- megköti az A-lánc 18000 D-os amino-terminális fragmensét;- nem csökkenti az u-PA enzimatikus aktivitását;- nem gátolja a pro-uPA enzimatikus aktiválását;- izoelektromos pontja 5,75. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimatikus aktivátort a plazmin, a trombin, a kallikrein és a tripszin közül választjuk ki. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az amidolitikus reakció során az u-PA meghatározáshoz szín-előhívó szubsztrátként piroglutamil-glicil-argmil-p-nitroanilidet alkalmazunk. 8. Reagens készlet az 1. igénypontban meghatározott eljáráshoz, azzal jellemezve, hogy a készlet tartalmaz: 1. egy analitikai segédanyagot, amelynek felülete a következő tulajdonságokkal jellemezhető monoklonális antitesttel van bevonva:- az IgGi osztályba tartóik,- az antigénhez KT6—10'11 affinitású,- specifikusan kötődik a nagymolekulatömegű 20 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
