201806. lajstromszámú szabadalom • Eljárás géntechnológiai uton módosított mikroorganizmusok által termelt tisztított növekedési hormon kinyerésére
HU 201806 B títása és koncentrálása a tisztított hormon vagy analógja kinyerésére. tumból elkülönített csapadék szuszpenziójának kezeléséhez a folyadék-szilárd anyag kontaktus és az ezt követő csapadék-elkülönítés előtt. Az utóbbi két lépést, valamint az ultraszűrést lehet ismételni. A 8. lépésben lehet ioncserélő kromatográfiát alkalmazni a hormonok vagy analógjának további tisztítására vagy koncentrálására. Ezen kívül a folyamat lépéseinek legtöbbjét folyamatos áramlással lehet kivitelezni és lehet automatizálni. A találmány szerinti eljárásban hormon-termelő bakteriális sejtként előnyösen a következő Escherichia coli törzseket alkalmazzuk: ATCC 39806, 39785, 39386, 39384, 39804 és 39792. A találmány szerinti eljárással kinyerhető és tisztítható példáid szarvasmarha, sertés, csirke és emberi növekedési hormonok és analógjaik. Közelebből a találmány szerinti eljárás új módszer tisztított eukarióta, pl. állati vagy emberi növekedési hormon vagy analógja kiynerésére olyan bakteriális sejtből, amelyben a növekedési hormon vagy analógja termelődött a hormont vagy analógját kódoló DNS szekvencia kifejeződésének segítségével. Az ebben a módszerben felhasznált, genetikailag módosított bakteriális sejtek ismertek. Egy ilyen genetikailag módosított Escherichia coli törzs a szarvasmaija növekedési hormon (bGH) egy analógjának termelésére pl. letétbe van helyezve az American Type Culture Collection-nál (ATCC, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) ATCC 39806 számon. A bGH analógban egy Met- Asp-Gln aminoszekvencia kapcsolódik a természetes bGH fenilalanin-formájának N-terminálisához. Egy másik genetikailag módosított E. coli sejtvonal, amely szintén letétbe van helyezve az ATCC- nél, ahol ATCC 39785 számot kapott, olyan bGH analógot állít elő, amelyben egy metionin maradék kapcsolódik a természetes bGH fenilalanin-formájának N-terminálisához. Megint egy másik E. coli törzs, amely szintén letébe van helyezve az ATCC- nél, ahol ATCC 39386 számot kapott, olyan emberi növekedési hormon (hGH) analógot állít elő, amely a természetes hGH aminosavszekvenciája MetW maradékával kezdődik, és hiányzik belőle az első 13, míg az ATCC 39384 számú E. coli sejtvonal olyan hGH analógot állít elő, amelyben az N-terminálisnál egy metionin előzi meg a természetes hGH szekvenciáját. Hasonlóképpen az ATCC 39804 és 39792 számú E. coli sejtvonalak sertés növekedési hormon (pGH) analógot, illetve csirke növekedési hormon (cGH) analógot termelnek, mindegyikben egy metionin-maradék kapcsolódik a megfelelő természetes hormon fenilalanin-formájának N-terminálisához. A fent említett hormon-analógok mindegyikét a megfelelő sejtek növesztésével és indukciójával lehet termelni megfelelő körülmények között, és a találmány szerinti módszerrel ki lehet nyerni tisztított formában. A találmány szerinti eljárás egyszerűbben hajtható végre jobban lehet szabályozni és kevésbé drága, mint a korábbi módszerek, és a kívánt termék nagyobb kitermeléssel és stabilabb formában nyer3 hető ki. Ezzel a módszerrel a termékeket több, mint 25%, vagy akár 30 tömeg% feletti kitermeléssel lehet kinyerni a baktériumokban a fermentáció végén jelen levő hormon vagy analógja tömegére vonatkoztatva. A lizozimot kisebb mennyiségben használjuk fel, mint amennyire a korábbi módszerekben szükség volt. A módszer nem igényli dezoxiribonukleáz használatát sem, végre lehet hajtani folyamatosan és kényelmesen lehet automatizálni. A megfelelő baktérium-sejt növekedése, indukciója, kinyerése és a felülúszó dekantálása után a baktériumsejteket, ezek fragmenseit, vagy a sejtszűrőlepényt megfelelő semleges pH-n, pl. 7,4-nél pufferolt oldatban szuszpendáljuk. Erre a célra megfelelő szuszpenziós közeg 50 mmól/liter Trisz (pH 7,4) és 50 mmól/liter NaCl; vagy 50 mmól/liter Trisz (pH 7,4) és 50 mmól/liter EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav); vagy 50 mmól/liter nátriumfoszfát puffer (pH 7,4) és 50 mmól/liter NaCl; vagy 50 mmól/liter nátrium-foszfát puffer (pH 7,4) és 50 mmól/liter EDTA vizes oldata. Egy más módszer szerint a fermentációs cefre sejt-szuszpenziót, pH-jának semlegesre állítása után, követlenül fel lehet használni. A szuszpendált baktérium-sejtek vagy ffagmenseik sejtfalát azután összezúzzuk, hogy lizátumot termeljünk. Egy előnyös kiviteli mód szerint a sejteket mechanikusan zúzzuk szét 35 °C-nál kisebb hőmérsékleten, pl. -10 "C és +8 °C között. Erre a célra golyós malom vagy homogenizátor, pl. Dynomill KD-5 berendezés (Willy A. Bachofen, Basel) vagy bármely megfelelő kereskedelmi forgalomban levő zúzóberendezés alkalmazható. A szétzúzást előnyösen úgy lehet végrehajtani, hogy a szuszpenziót zúzóberendezésen folyamatosan átengedjük a megfelelő áramlási sebességgel (pl. 80 liter/óra). A szemcséket és oldhatatlan anyagokat, beleértve a hormont vagy analógját és más vízoldhatatlan fehéijéket, valamint sejtmembrán és sejtfal fragmenseket és aggregátumokat, ezután elkülönítjük a lizátumból, amely szintén tartalmaz vízoldható fehérjéket, DNS-t és RNS-t vagy ezek fragmenseit. Hogy ezt az elkülönítést hatásossá tegyük, a lizátumot előnyösen hígítjuk megfelelő mennyiségű, pl. közel azonos térfogatú ionmentes vízzel, majd centrifugáljuk egy szilárd-hengeres folyamatos áramlású centrifugában (pl. Cepa 101-ben) olyan áramlási sebességet alkalmazva, amely megfelelő a kívánt elkülönítés hatásos végrehajtására, pl. 60-80 liter/óra sebességgel. Ezután az elkülönített csapadék szuszpenzióját készítjük el semleges, pl. 7,4 pH-jú megfelelő puffer alkalmas mennyiségében. A pufferoldat előnyösen 50 mmól/liter Trisz-t vagy nátrium-foszfátot (pH 7,4) és 50 mmól/liter EDTA-t tartalmaz. A szuszpendáláshoz megfelelő pufferoldat-mennyiség kb. 0,5-2,5 liter 1 kg kiindulási baktériumsejthez, előnyösen 1,2 liter/1 kg sejt. A nem kívánatos sejtanyagokat, pl. sejtfal-fragmenseket azután el lehet emészteni úgy, hogy a szuszpenziót olyan enzimmel inkubáljuk, amely képes a szuszpenzióban jelen levő poliszacharidokat emészteni, pl. lizozimmal (Sigma L-687, St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok), a megfelelő körülmények között és megfelelő időtartamon át. A lizozim legelőnyösebb koncentrációja kb. 50-4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
