201804. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-keto-L-gulonsav előállítására mikrobiológiai úton
7 HU 201804B 8 * A táplálkozási igényeiket tekintve a fenti 5 törzs, a K591s, 12-5 és 12-15 növekedésére az a jellemző, hogy Koenzim-A szükséges növekedésükhöz. A koenzim-Ahárom törzsesetén pantoténsawalnemhelyettesíthető. Másrészt a 1-24, 22-3 pantoténsav vagy koenzim-A jelenlétében egyaránt növekszik. A leírásban a Pseudogluconobacter saccharoketogenes törzseket néha oxidativ törzsekként említjük. A találmány szerinti eljárásban nemcsak a fentiekben leírt 5 törzset, de a fenti törzsből UV besugárzás, röntgen-sugárzás, kémiai mutagénekkel, például N-metil-N’-nitro-N-nitrozoguanidinnel (nitrozoguanidinnel), metil-metán-szulfonáttal, nitrogén mustárral, stb. való kezelés hatására létrejött mutánsaikat is alkalmazhatjuk. Példaként az ilyen mutánsokra a TH 14-86 törzset említhetjük, melyet a Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s törzsből nyertünk nitrozoguanidinnel való kezeléssel. A TH 14-86 mutáns törzs ugyanolyan taxonómiai tulajdonságokkal rendelkezik, mint a K591s törzs, azzal az eltéréssel, hogy L-szorbózból jobban képes 2-keto-L-gulonsavat előállítani. A fentiekben említett Pseudogluconobacter saccharoketogenes K-59 Is, 12-5, TH-14-86 törzseket az Osakai Fermentációs Intézetben (IFO) 1985. szeptember 19-én, míg a Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15,12-4 és 22-3 törzseket 1985. december 16-án helyezetük letétbe. Ezen kívül a Pseudogluconobacter saccharoketogenes K59 Is, 12-5, TH 14-86 törzseket a Nemzetközi Kereskedelmi és Ipari Minisztérium Ipari Tudomány ésTechnológiai Irodájának Fermentációs Kutatási Intézetében (FRI) 1985. október 7-én, míg a Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15, 12-4 és 22-3 törzseket 1985. december 20-án helyeztük letétbe. A letétbe helyezést a Budapest Egyezmény szerinti letétbehelyezéssé alakítottuk át, és ezeket a mikroogranizmusokat a FRI 1986. augusztus 9. óta nyüvántartja és tárolja. A törzsek IFO és FRI deponálási számai a következők: Mikroorganizmus neve IFO FRI saccharoketogenes 22-3 14484 P-8578 BP-1133 A találmány szerinti eljárás során a fenti törzse- 5 két L-szorbóz tartalmú közegben tenyészthetjük, vagy L-szorbózt adhatunk a fenti törzsekből készített sejtpreparátumhoz. A „sejtpreparátum” kifejezés alatt a baktérium tápközegéből kimosott, acetonnal szárított, hordo- 10 zótra felvitt úton (például poliakrüamid gélre, K- karragénre és hasonlóra felvitt) iinmobüizált sejteket, vagy egyéb ekvivalens preparátumokat értünk. A kiindulási anyagként használt L-szorbózt rögtön egyszerre adhatjuk a tápközeghez a tenyésztés 15 kezdetén, vagy több részletben a tenyésztés folyamán, vagy tenyésztés közben folyamatosan. A rendszerben az L-szorbóz koncentrációja 3- 30, előnyösen 5-25 tömeg/térfogat% a tápközegre számítva. 20 L-szórbózból úgy állíthatunk elő 2-keto-L-gulonsavat, hogy az adott sejtpreparátumhoz 2-(N- morfolino)-etánszulfonsav (MES) puffert (pH-6,5; 0,5 M) és kalcium-karbonátot adunk, vízzel hígítjuk, és az elegyet egy kúp alakú lombikba rázzuk. 25 Az üyen reakcióelegyben azL-szorbóz és a sejtpreparátum közötti legjobb érintkezést biztosító L- szorbóz koncentráció 0,1-10 tömeg/térfogat%, előnyösen 0,3-3 tömeg/térfogat%. A sejtpreparátum mennyisége száraz sejtre számítva 1-30 mg/ml. A 30 reakcióelegy pH-ját 5,5-7,5 közötti értéken kell tartani, a reakció hőmérséklete kb. 20-40 'C, és a reakcióidő kb. 1-100 óra. A találmány megvalósítása során úgy találtuk, hogy amikor egy Pseudogluconobacter saccharoke- 35 togenes törzset L-szorbóz tartalmú folyékony tápközegben tenyésztve 2-keto-L-gulonsavat állítunk elő, a 2-keto-L-gulonsav nagyobb mennyiségben képződik akkor, ha a Pseudogluconobacter oxidativ törzsön kívül más baktériumot is tartalmaz a tápkö- 40 zeg, mint akkor, ha csak az oxidativ törzset önmagában tenyésztjük. Második baktériumként például a Bacillus, Pseudomonas, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Xanthomonas és Flavobacterium nemzetség- 45 bői származó törzseket alkalmazhatunk. Specifikus példaként a következőket említhetjük: Pseudogluconobacter saccharoketogenes K591s 14464 Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-5 14465 Pseudogluconobacter saccharoketogenes TH 14-86 14466 Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-15 14482 Mikroorganizmus neve Pseudogluconobacter saccharoketogenes 12-4 14483 Pseudogluconobacter Bacillus cereus IF03131 P-8481 BP-1130 Bacillus lichenif ormis IFO 12201 50 Bacillus megaterium IFO 12108 Bacillus pumilus IFO 12090 P-8480 BP-1129 BacUlus amyloliquefaciens IFO 3022 Bacillus subtüis DFO13719 Bacillus circulans IFO 3967 P-8479 BP-1128 55 Pseudomonas trifolii IFO 12056 \ 1 Pseudomonas maltiophilia IFO 12692 j Proteus inconstans IFO 12930 P-8577 BP-1132 í Citrobacter freundii IFO 13544 Enterobacter colacae IFO 3320 IFO FRI 60 Erwinia herbicola IFO 12686 Xanthomonas pisi IFO 13556 Xanthomonas citri IFO 3835 Flavobacterium menigosepticum EFO12535 P-8576 BP-1131 Micrococcus variáns IFO 3765 65 Eshercia coli IFO 3366 \ 5
