201802. lajstromszámú szabadalom • Hatóanyagként bacillus thuringiensis hibridsejteket tartalmazó peszticid készitmény és eljárás a hibridsejtek előállítására
HU 201802 B A találmány tárgya Bacillus thuringiensis (az alábbiakban: B. t.) hibridsejteket tartalmazó peszticid készítmény és eljárás a hatóanyagként alkalmazott B. t. hibridsejtek előállítására. Közelebbről, a találmány olyan B. t. hibridsejtek előállítására vonatkozik, amelyek egy B. t. kurstaki delta-endotoxmt kódoló gént hordozó plazmidot és egy B. t. tenebrionis delta-endotoxint kódoló gént horodozó plazmidot tartalmaznak; ezek a hibridsejtek egy endotoxinkristályt termelő B. t. kurstaki törzs és egy endotoxinkristályt termelő B. t. tenebrionis törzs konjugácójával hozhatók létre, és mind a B. t. kurstaki törzsre jellemző delta-endotoxinkristályok, mind a B. t. tenebrionis törzsre jellemző delta-endotoxinkristályok termelésére képesek. A B. t. kurstaki törzsek delta-endotoxinlaistályai kettős piramis-alakúak. A B. t. tenebrionis törzsek deltaendotoxinkristályai hasáb (vagy kocka-) alakúak. A találmány szerinti eljárással előállított B. t. hibridek révén lehetővé válik biológiai úton olyan kártevők irtása, amelyek a B. t. kurstaki és a B. t. tenebrionis anyatörzsekkel elpusztíthatók. A találmány szerint a B. t. hibridsejteket a szokásos módon kaphatjuk úgy, hogy egy delta-endotoxint termelő B. t. kurstaki törzset és egy delta-endotoxint termelő B. t. tenebrionis törzset konjugálunk, s az így kapott B. t. hibridsejteket ismert módon elkülönítjük. A konjugáció technikai megoldásai a géntechnológia területén jól ismertek [lásd például: J. M. Gonzalez és B. C. Carlton: „Plasmid Transfer in Bacillus thuringiensis”, a következő helyen: „Genetic and Cellular Technology”, 1 kötet, 85-95. oldal (A genetikai kicserélődésről), szerk. L. P. Gage, 1982], Marcel Dekker, Inc., New York és Basel)]. A konjugációt előnyösen egy konjugáló plazmiddal valósítjuk meg: célszerűen alkalmazhathatjuk például a Streptococcus faecalis-ból kapott pAMBl plazmidot, amelyet általában ß-plazmid néven ismernek. Ez utóbbit ismert módszerrel vezethetjük be egy B. t. törzsbe (lásd például H. M. Fischer: „Plasmid und Plasmidübertragung bei Bacillus thuringinesis”, PHD Thesis ETH Nr. 7375, Swiss Federal Institute of Technology, ADAG Administration and Drick AG, 1983, 83 oldal: valamit Gonzalez és munkatársai fentebb idézett munkája). Az így kapott ß-plazmidot tartalmazó B. t. törzs donorként szerepe a kurstaki és tenerbrionis törzsek közötti konjugációban. A konjugátumok (azaz a találmány szerinti eljárással előállított, hibrid B. t. törzsek) kimutatásának és elkülönítésének megkönnyítésére mind a donor, mind a befogadó (recipiens) sejtet genetikai jelzővel (markerrel) látjuk el. Az ilyen jelzők ismert módon vezethetők be. Ismeretes például, hogy gram-pozitív baktériumokban a ß-plazmid eritrimicinnel szemben rezisztenciát hoz létre. Ez a sajátság felhasználható minden olyan törzs kiküszöbölésére, amelyek a konjugáció után ezzel a sajátsággal nem rendelkeznek. Ha a másik konjugációs partnert is jelezzük, például egy másik antibiotikummal - így tetraciklinnel - szemben megnyilvánuló, indukált vagy spontán rezisztenciával, akkor lehetségessé válik az összes olyan törzsek kiküszöbölése, amelyek nem 1 rendelkeznek mindkét genetikai jelzővel (azaz lehetővé válik a nem konjugált törzsek eltávolítása). Ez úgy érhető el, hogy a mikroorganizmusokat megfelelő, eritromicint és tetraciklint tartalmazó táptalajon szaporítjuk. Ilyen táptalajon csak azok az organizmusok lesznek képesek a szaporodásra, amelyek mindkét genetikai jelzővel - tehát mind az eritromicinnel, mind a tetraciklinnel szemben megnyilvánuló rezisztenciával - rendelkeznek. A találmány szerinti eljárással előállított B. t. hibrideket ismert módon különíthetjük el például úgy, hogy mind a B. t. kurstaki, mind a B. t. tenebrionis törzsekre jellemző típusú kristályokat tartalmazó tenyészeteket vizuálisan azonosítjuk; vagy pedig az azonosítást ismert módon, biológiai vagy biokémiai módon végezzük. A találmány szerint a B. t. hibridsejtek előállítása céljából előnyösen úgy járunk el, hogy egy B. t. kurstaki törzset egy B. t. tenebrionis törzzsel konjugálunk, aminek során a donortörzs valamilyen konjugáló plazmidot, és mind a donor, mind a befogadó törzs az elkülönítés szempontjából megfelelő genetikai jelzőt tartalmaz. Általában úgy járunk el előnyösen, hogy a találmány szerinti eljárás végrehajtása során a konjugációs folyamatban egy B. t. kurstaki törzset alkalmazunk donorként. A konjugálást célszerűen valamilyen nitrogénforrást, szénhidrátokat és szaporodást elősegítő anyagokat tartalmazó közegben, 20-40 °C hőmérséklettartományban végezzük. A kiinduló anyagokat a szokásos módon nyerhetjük úgy, hogy ismert B. t. kurstaki és B. t. tenebrionis törzsekből indulunk ki. Az inkubálás időtartma általában 4-96 óra, aminek során a cseppfolyós közeget célszerűen levegőztetjük vagy rázatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított B. t. hibrid törzseket az Amerikai Egyesült Államok Földművelésügyi Kutató Szolgálatának Északi Körzeti Kutatási Központjában (NRRL) NRRL ß-18011, NRRL B-18012 és NRRL B-18013 számon helyeztünk letétbe. A találmány szerinti eljárást az alábbi nemkorlátozó jellegű kiviteli példában részletesen ismertetjük. É példában ß-plazmidot tartalmazó donorként B. t. kurstaki törzset alkalmazunk; ez a plazmid olyan konjugáló plazmid, amely jelzőként eritromicin-rezisztenciával rendelkezik. A befogadó B. t. tenerbrionis törzs spontán tetraciklin-rezisztenciával rendelkező mutáns. Az alábbiakban a hőmérséklet-értékeket Celsius-fokban, a részeket tömegrészben adjuk meg. Példa A konjugáció végrehajtása 2,5 ml logaritmikus növekedési szakaszban levő B. t. kurstaki HD-73 (NRRL N-4488) törzstenyészetet, amely a Streptococcus faecalis pAMBl konjugáló fragmentumát tartalmazza, és 2,5 ml logaritmuikus növekedési fázisban levő, spontán tetraciklin-rezisztens B. t. tenebrionis mutáns tenyészetet (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen, DSM 2803) (mindkettőből körülbelül 5 x 107 sejt/ml) összekeverünk, majd cellulóz-acetát membránszűrőn (Oxid/Nuflow; 0,45 |im nyílásnagyság, 25 mm 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
