201800. lajstromszámú szabadalom • Eljárás t-PA és SCU-PA termelésének növelésére
HU 201800 B 11 12 V. TÁBLÁZAT t-Pa termelése faktorokkal (ECGF + heparin) vagy azok nélkül, visszavezetéssel nap t-Pa (ng/ml) faktorok faktorokkal nélkül í. ciklus 2 15 150 3 30 140 4 25 130 2. ciklus 2 50 760 3 100 1165 4 240 1136 3. ciklus 2 600 650 3 560 960 4 500 910 4. ciklus 2 50 260 A meghatározáshoz a később leírt ELISA t-PA mérést használjuk. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ECGF és heparin kombinációja nagy mértékben növeli a t-PA termelését szérummentes tápközegben, amikor a sejteket visszavezetjük egy hosszabb időtartamú termelési műveletben. A t-PA termelésének szintjét ECGF/heparinnal stimulált WI-38 tenyészetekben így 200- 1000 ng/106 sejt/nap nagyságrendben határozzuk meg. Azt is megállapítjuk, hogy a fibroblaszt diploid sejteket legalább kétszer, esetleg háromszor vissza lehet vezetni, hogy t-PA-t termeljenek. így, amint ezt a fenti V. Táblázat bemutatja, az olyan tenyészeteket, amelyeket t-PA termeléséhez stimuláltunk, 48 óra múlva visszatápláljuk növesztő tápközeggel (amely 10% boíjúembríó szérumot tartal- 5 máz), majd ezt követően (öt nap után) újra stimuláljuk szérummentes, ECGF és heparin-tartalmú tápközegben. Az eredmények azt mutatják, hogy a sejtek képesek t-PA termelésére olyan szinten, amely összehasonlítható mértékű vagy nagyobb, 10 mint a primer stimulálás után megfigyelt. A faktorok maximális koncentrációjánál (ECGF 50 p.g/ml-nél és heparin 90 ng/ml-nél) hasonló eredményeket kapunk tekintet nélkül arra, vajon a diploid fobroblaszt szövettenyésztő lemezeken te- 15 nyésztjük (amely 95% levegő és 5% CO2 jelenlétében növekszik), vagy zárt szövettenyésztő üvegedényben tenyésztjük, 25 cm2 -150 cm2 mérettartományban. A találmányt gyakorlatban sikerrel hajtjuk végre 200-as szinten (teljes nedves sejt-tö- 20 meg mintegy 8 g 150 cm-es üvegedényben a rekombináns munkákhoz szükséges hírvivő RNS termelésének folyamán. Az alábbi VI., VII., és VIII. Táblázatokban a t-PA, SCU-PA, illetve t-PA termelését mutatjuk 25 be, heparint és tisztított ECGF-et alkalmazva különböző tisztított ECGF koncentrációknál. WI-38 fibroblaszt sejteket és szérummentes tápközeget alkalmazunk ezekben a kísérletekben. Mindhárom kísérletben a heparin, ahol alkalmazzuk, 90 (ig/ml 30 koncentrációban van. Ezekben a táblázatokban a standard ECGF-et „ECGF’-nek jelöljük, míg a tisztított ECGF-et „p-ECGF’-nek jelöljük. VI. TÁBLÁZAT t-PA termelése standard ECGF-fel és tisztított ECGF-fel különböző koncentrációknál Idő (óra) 8 24 48 72 Tápközeg t-PA (ng/üreg) 1. RPMI egyedül-10 — 2.50 ng/ml ECGF 19 70 85 56 3.90 ng/ml hep. 15 8 21 12 4.50 ng/ml ECGF 20 71 218 320 + 90 ng/ml hep. 5.50 ng/ml p-ECGF _ 8 14 _ 6.50 ng/ml p-ECGF-17 59 46 + 90 ng/ml hep. 7.100 ng=ml p-ECGF 19 63 __ 8.100 ng/ml p-ECGF 2,8 37 99 200 + 90 ng/ml hep. 9.200 ng/ml p-ECGF 2,4 28 28 10.200 ng/ml p-ECGF + 90 ng/ml hep. 65 188 437 VII. TÁBLÁZAT SCU-PA termelése standard ECGF-fel és tisztított ECGF-fel különböző koncentrációknál Idő (óra) 8 24 48 72 Tápközeg SCU-PA (ng/üreg) 1. RPMI egyedül 32 22 47 134 2.50 ng/ml ECGF 160 281 186 289 3.90 ng/ml hep. 121 101 103 130 7
