201800. lajstromszámú szabadalom • Eljárás t-PA és SCU-PA termelésének növelésére
HU 201800 B amelyeket endotéliális sejtnövesztő faktoroknak azonosítunk és amelyeket benne foglaltatnak az endotéliális sejtnövesztő faktor fogalmában ahogyan itt alkalmazzuk. így Schreiber Alan B. és munkatársai (The Journal of Cell Biology, 101, 1123- 5 1626 (1985/) meghatározták, hogy a savas, agy-eredetű fibroblaszt növekedési faktor (savas FGF), és a szarvasmarha szem-eredetű II. növekedési faktor (EDGF-II) ebbe az endotéliális sejtnövesztő faktor (ECGF) családba tartozik. Javasolták továbbá, 10 hogy az a-heparing kötő növekedési faktort (a- HGF), savas hipotalamusz eredetű növekedési faktort (savas HDGF), és retina eredetű növekedési faktort (RDGF) szintén úgy határozzák meg, hogy ebben az endotéliális sejtnövesztő faktor (ECGF) 15 családba tartozzanak. Mégis a hipotalamusz-eredetű növekedési faktor az igazán használatos ennek a találmánynak a gyakorlati alkalmazásában. Schreiber és munkatársai (fentebb idézett munka, 1625. oldal) a következő tényezőket írják le, 20 amelyeket alkalmaztak, hogy megállapítsák, melyik endotéliális sejt polipeptid faktor családba: (a) heparin affinitás; (b) kereszt-reaktivitás poliklonális ECGF antiszérumokra és monoklonális ECGF antitestekre; (c) versengés ECGF-fel a nagy affmitású 25 endotéliális sejt eredetű receptorokhoz való kötésért; és (d) hatékony heparin potenciroz. Ezen kívül az ECGF ellen készített antitestek gátolják a savas FGF és EDGF-II mitogén aktivitását, továbbá bizonyítékokat nyújtva a családok rokonságá- 30 hoz. így az ezeket a jellemzőket, főleg az (a), (c) és (d) szerinti jellemzőket mutató endotéliális sejtnövesztő faktorok beletartoznak a jelen találmány 5 gyakorlati megvalósításához megfelelő enditéliális sejtnövesztő faktorok közé. A különböző ismert endotéliális sejtnövesztő faktorok előállítása és tisztítása a szakirodalomban le van írva. így pl. a savas FGF kivonását és tisztítását Thomas K. és munkatársai írják le (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 81,357-361 /1984[). A VI., VII. és VIII. Táblázatok mutatják be a jelen találmány szerinti t-PA és SCU-PA termelést a tisztított „p-ECGF” endotéliális sejtnövesztő faktort alkalmazva. A tisztított ECGF szintén beszerezhető a kereskedelemben a Collaborative Research Inc.-től (Lexington, Massachussets). Ezt az anyagot Burgess W. H. és munkatársai eljárása szerint készítik (Journal of Biological Chemistry, 260,11,389-11,392/1985/), és 90%-os vagy nagyobb tisztaságú. Amikor ezt a t-PA és/vagy SCU-PA termelésében alkalmazzuk a jelen találmány szerint, tisztított ECGF-et (p-ECGF) adunk a tenyésztő közeghez 25 nanogramm/ml (ng/ml) vagy nagyobb koncentrációban. A tisztított ECGF előnyös koncentráció tartománya 50 nanogramm/ml és 500 nanogramm/ml között van. A tisztított ECGF különösen előnyös koncentrációja 100 nanogramm/ml és 300 nanogramm/ml között van. Az alábbi I. Táblázat bemutatja a találmány szerinti heparin + ECGF koncentráció potencirozó hatását a t-PA termelésére humán diploid tüdő fibroblaszt sejtek WI-38 és MRC-5 törzseiből. Ezekben az eljárásokban a hepaint 90 p.g/ml koncentrációban és az ECGF-et 50 p.g/ml koncentrációban alkalmazzuk. 6 I. Táblázat Normál humán fibroblaszt által végzett t-PA termelés függősége ECGF és heparin jelenlététől szérummentes tápközegben Sejt-típus Tenyészet száma/tc Idő (óra) semmi RPMI-1640 plusz heparinb ECGF0 t-PAd (ng/üreg) heparin/ECGF WI-38 C8/tc28 24 0 0 0,3 22,6 46 0 0 16,5 136,5 96 0 0 7,1 193,1 WI-38 C9/tc24 24 0 0 13,9 33,9 46 4,2 15,9 31,0 146,0 96 8,8 19,7 31,0 192,2 WI-38 C14/tc25 24 8,1 14,9 32,3 72,0 46 13,0 26,8 34,9 134,7 96 15,5 15,2 25,9 220,6 MCR-S tc25 24 9,7 10,5 28,2 43,3 96 22,4 26,9 35,3 256,7 a) A tenyészet száma különböző időpontokban liofilezett egyedi tenyészetekre vonatkozik. A te a szövettenyészet átoltásának szintjét jelzi (azaz az a szám, ahányszor a tenyészetet átoltottuk, általában kettőzéssel) b) A heparint 90 p.g/ml koncentrációban alkalmazzuk. c) Az ECGF-et (endotéliális sejtnövesztő faktor) 50 |xg/ml koncentrációban alkalmazzuk. d) A t-PA-t (szöveti plazminogén aktivátor) ELISA méréssel határozzuk meg, tisztított humán méh t-PA ellen irányuló IgG-t alkalmazva 4
