201783. lajstromszámú szabadalom • Eljárás parciálisan metilezett karboxi-acil-béta ciklodextrinek és sóik előállítására
HU 201783 B 9 10 jük és mossuk 1x200 cm telített nátriumklorid + 50 cm3 2N nátriumhidrogénszulfát oldattal, majd 3x200 cm3 telített nátriumldorid oldattal. A szerves fázist szárítjuk, vákuumban szárazra pároljuk. A kapott fehér, porszerű trideka-O-me- 5 til-mono-szukcinil-béta-ciklodextrin termék tömege: 5,2 g. A vizes fázishoz 40 cm 2N nátriumhidrogénszulfát oldatot adunk és 1x200 cm3 etilacetáttal mosva eltávolítjuk a maradék mono-szukcinil tér- 10 méket. A vizes fázishoz újabb 40 cm3 2N nátriumhidrogénszulfát oldatot adunk és 3x300 cm3 etilacetáttal extraháljuk. Az etilacetátos részeket egyesítjük, a fentiek szerint mossuk, szárítjuk, szárazra pároljuk. 15 A kapott fehér, porszerű dodeka-O-metil-di-karboxi-propionil-béta-ciklodextrin termék súlya: 2,8 g. 7. példa 20 Trideka-O-metil-mono-karboxi-propionil-béta -ciklodextrin metilészter előállítása 1,42 g (1 mmól) 2. sz. példa szerint előállított trideka-O-metil-mono-karboxi-propionil-béta ciklodextrint feloldunk 2,8 cm3 vízmentes tetrahidro- 25 furánban. A kapott oldathoz 7 cm3 (2,1 mmól) éteres diazometán oldatot adunk. A reakcióelegyet hidegvizes fürdőben kevertetve a reakció 15 perc alatt lejátszódik. Ezt követően a reakcióelegyet vákuumban szárazra pároljuk. Az amorf porként 30 nyert termék tömegére: 1,43 g. Rf érték Ei eluensben: 0,69 krHNMR: -COOCH3:3,8 ppm. 8. példa 35 Trideka-0-metil-mono-(3-karbometoxi-propi onil)-béta-ciklodextrin előállítása A reakciót a 2. példában leírtak szerint végezzük, azzal az eltéréssel, hogy acilező ágensként 6,0 g (40 mmól) 3-karbometoxi-propionil-kloridot alkal- 40 mázunk és a reakciót 0 °C-on vezetjük. A reakció lejátszódása után a reakcióelegyhez 200 ml etilacetátot adunk és sorrendben mossuk 2x200 ml telített sóoldattal, 1x200 ml telített só+ 50 ml 2N nátriumhidrogénszulfát oldattal, 45 1x200 ml telített só +100 ml lM-os nátriumhidrogénkarbonát oldattal, 1x200 ml telített só oldattal. A szerves fázist szárítjuk, derítjük, szűrjük és vákuumban szárazra pároljuk. A kapott vegyidet tömege: 13,4 g. 50 Rí érték Ei eluensben: 0,69. H-NMR: OOC-ÍCH?t?-COO: 2,65 ppm -COOCHr 3,80 ppm. 9. példa 55 Trideka-O-metil-mono-karboxi-propionil-béta biklodextrin (SUMEB) előállítása A reakciót a 2. példában leírtak szerint végezzük, azzal az eltéréssel, hogy katalizátorként 0,80 g (4 mmól) 4-pirrolidino-piridint alkalmazunk. A ka- 60 pott végső tiszta termék tömege: 7,1 g. Rt érték E-l eluensben: 0,16 egy foltos E-2 eluensben: 0,50 egy foltos H-NMR: C(l)-H + C(3)-OH: 5,00 ppm vázprotonok: S-4,5 ppm 96 db proton 65 C(2)-OCH3 és C(6)-OCH3: 3,65 és 3,42 OOC-(CH2)2-COO: 2,65 ppm 4 db proton Olvadáspont: 270-280 °C (bomlik). 10. példa A hemolizáló hatás vizsgálata A vizsgálandó anyagokból 10 mM-os oldatokat készítettünk (10 mM-os foszfát pufferben pH 7,4 történt az oldás), a-, ß-, y-ciklodextrinek: a CHINOIN (Budapest) által gyártott, kereskedelmi forgalomban kapható termékek. DIMEB és TRIMEB: A béta-ciklodextrin már közölt parciális, illetve teljes metilezésével előállított heptakis-2,6-di-0-metil)- illetve heptakis (2,3,6-tri-0-metil)-ß-ciklodextrin. Az eritrociták előkészítése Citráttal, mint alvadásgátlóval levett friss humán vért (melynek egészséges, gyógyszeres kezelés alatt nem álló donortól kell származnia) 10 percen át centrifugáltunk 2.000-3.000 g közötti tartományban, maid a felülúszót leöntöttük, és az eritrocitákat 5-5 cm3 10 mM-os izotóniás foszfát-pufferben felszuszpendáltuk, és ismét 2.000-3.000 g közötti fordulatszámmal 10 percen át centrifugáltuk. A műveletet még kétszer megismételtük, a kapott eritrocitákat izotóniás foszfát-pufferrel felszuszpendálva úgy hígítottuk, hogy kb. 10%-os hematokrit térfogatot kapjunk. A továbbiakban ezt a szuszpenziót használtuk a méréseinkhez (legfeljebb 48 órán át volt eltartható a szuszpenzió jégszekrényben, 4 °C körüli hőmérsékleten). Mérési módszer: 4 cm össztérfogatú vizsgálandó oldathoz, amely különböző koncentrációkban tartalmazta a vizsgált ciklodextrineket és származékokat, 0,4 cm3 eritrocita-szuszpenziót adtunk, majd 30 percig 37 °C-on inkubáltuk az elegyet. Vakpróbaként 4 cm3 izotóniás foszfát-puffer és 0,4 cm3 eritrocita szuszpenió elegyét használtuk (ezt is a mintákhoz hasonlóan kezeltük.) A 30 perc letelte után a centrifugacsövekben lévő szuszpenziókat 10 percig centrifugáltuk úgy, hogy a fordulatszámot 250-500 g között tartottuk. (Azt tapasztaltuk, hogy ennél rövidebb ideig tartó centrifugálás nem ad áttetsző, spektrometriás mérésre alkalmas tisztaságú felülúszót). A 10 perc letelte után az egyes felülúszókat leszívattuk, és extinciójukat 543 nm-nél vakpróbával szemben fotometriásan határoztuk meg. Ahhoz, hogy a hemolízis %-át meg tudjuk adni, ismernünk kellett a teljes hemolízis után mért extinkciót. Ennek értékét úgy kaptuk, hogy 4 cm3 desztillált vízhez 0,4 cm3 eritrocita-szuszpenziót adtunk, majd inkubálás és centrifugálás következett ugyan úgy, ahogyan azt a minták esetében tettük. Az így nyert oldat extinkciója adta a 100%-os hemolízis-értéket, ehhez viszonyítottuk a minták mért extinkcióit, és a hemolízis-fokot ehhez viszonyított %-os értékkel kaptuk. Eredmények Nem-szubsztituált ciklodextrinek a-ciklodextrin esetében 6 mM-os koncentráció-6
