201775. lajstromszámú szabadalom • Eljárás interferon tisztítására
HU 201775 B A találmány rekombináns DNS technológiával előállított interferon hatású polipeptid tisztítási eljárására vonatkozik, amely tisztítás során a polipeptid nem denaturálódik és proteázok okozta bomlást sem szenved; még részletesebben, az említett polipeptidet olyan mikroorganizmus állítja elő, amelyet egy interferon hatással rendelkező polipeptidet kódoló gént tartalmazó plazmid vektorral transzformálunk. A találmány különösen hatékony módszert szolgáltat egy kívánt polipeptidnek valamely mikroorganizmus tenyészetéből való tisztításához, ahol az illető mikroorganizmus interferon aktivitást — különösen humán immun (vagy gamma) interferon aktivitást — kifejtő polipeptid előállítására képes. Az interferon proteinek három típusra oszthatók fel, alfa, béta és gamma típusú interferonokra (rövidítve: IFN-a, IFN-ß, illetve IFN-7), antigenitási és szerkezeti különbségeik alapján. A gamma interferonnak számos olyan jellemzője van, amely megkülönbözteti az alfa- és béta-interferontól. Ezen különbségek közt szerepel az antigenitás különbözősége, továbbá nagyobb hatást fejt ki az immunfolyamatok szabályozásában és tumor ellenes aktivitása is nagyobb. A humán gamma interferont (a továbbiakban h-IFN-^) olyan T limfociták termelik, amelyek mutagénekkel vagy olyan antigénekkel stimuláltak, amikkel szemben a T limfociták szenzitizálódtak. A szakterületen jól ismert klónozási és expressziós módszerekkel is elő lehet állítani h-IFN-^y-t. Legújabban a génmanipulációs módszerek fejlődése lehetővé tette számos fiziológiailag aktív polipeptid termelését mikroorganizmusok és állati sejtek segítségével úgy, hogy ezeket az anyagokat az illető szervezetből elválasztással és tisztítással állítják elő. Mindazonáltal még nem mondható el, hogy kialakult volna olyan módszer egy kívánt anyag kivonására és tisztítására, amely gyógyszerként való felhasználáshoz megfelelő tisztaságot biztosítana és amely nem okoz denaturációt vagy lebomlást. A kapott gamma interferon tartalmú sejteket összegyűjtik és különböző módon roncsolják, például ozmotikus sokkal, ultrahangos feltárással, őrléssel, nagy nyíróerővel való roncsolással. Ezután az elroncsolt sejt és a gamma interferon keverékét feldolgozzák a gamma interferon izolálása céljából. Az oldhatatlan anyagokat centrifugálással választják el és a gamma interferon tartalmú felülúszót elkülönítik és tisztítják. Bár ilyen előállítási eljárások szerepelnek már szabadalmi leírásokban, ilyen például a rekombináns mikroorganizmusban termelt polipeptid kivonása és tisztítása guanidin-hidroklorid és karbamid felhasználásával (161321/1984. számú japán közrebocsátási irat és 4.476.049. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), vagy tisztítási módszer monoklonális antitest felhasználásával (186995/1984. számú japán közrebocsátási irat), azonban a kívánt anyag nem volt mindig megfelelően tiszta, denaturáció lépett fel és inaktiválódott. A 0.087.686. számú európai közrebocsátási irat egy háromlépcsős eljárást ír le, amely humán immun interferon tisztítására vonatkozik sejtmentes felülúszóból vagy nyers interferon alapanyag kivonatából. Az első lépésben (természetben előfordu1 ló interferon esetén) affinitás oszlopot — ilyen a ConcanavalinA-Sepharose — használnak; ezután egy karboximetil-szilika oszlopon való kromatografálás következik, növekvő sótartalmú grádiens alkalmazásával, végül egy szilikagél töltetű oszlop. Az esetben, ha megfelelő tisztaságot úgy nem érnek el, vagy TSK vagy CM oszlop kromatográfiát alkalmaznak. A 0.063.482. számú európai közrebocsátási irat olyan tisztítási eljárásra vonatkozik, amely kromatográfiás módszereket alkalmaz: 1) CPG (Controlled Pore Glass = ellenőrzött üvegszemcsék); 2) ConcanavalinA-Sepharose; 3) Heparin-Sepharose vagy Procion Red-Agarose; és 4) gélszűrés. A 0.107.498. és 0.077.670. számú két európai közrebocsátási irat a következő lépésekből álló tisztítási eljárásra vonatkozik: 1) kicsapás polietiléniminnel; 2) bakteriális proteinek kicsapása pH beállítással; 3) koncentrálás és dialízis; 4) kromatografálás a) karboxi-metil-cellulózon, b) kalciumfoszfát gélen, c) karboximetil-cellulózon és d) gélszűrő gyantákon. Minthogy ezek a tisztítási eljárások sok lépést igényelnek, bekövetkezik az interferon bomlása, azaz az interferon molekula degradálódik vagy aggregálódik, vagy az lesz az eredmény, hogy a kapott interferon termék kitermelése és aktivitása alacsony lesz. Magától értetődik tehát, hogy egy kívánt polipeptid izolálása és tisztítása a kívánt polipeptidet előállító mikroorganizmus tenyészetéből úgy, hogy a kívánt anyag ne veszítsen aktivitásából és ne kísérje denaturálódás, nagyon fontos lenne olyan esetben, amikor ezek az anyagok gyógyszerként kerülnek felhasználásra, de az ipar szempontjából is lényeges lenne ilyen technológiának a kidolgozása. Egy ilyen tisztítási módszer különösen kívánatos lenne az interferon esetében, tekintve, hogy gyógyszerként való alkalmazása most van folyamatban. Az interferonok vírus ellenes aktivitást fejtenek ki, de az IFN-^/-nál várható, hogy mint tumor ellenes szer és mint immunregulátor is felhasználható lesz, mivel különlegesen erősen gátolja a sejtek növekedését. Ezenfelül az interferon aktivitásnak többféle specificitása van. Például, ha az interferont gyógyszerként használják, előnyösebb olyan interferont használni, amely humán eredetű. Ezenfelül kívánatos, hogy a géntechnológiával előállított interferon izolálására és tisztítására rendelkezésre álljanak módszerek. Rekombináns mikroorganizmusok révén kapott polipeptidek izolálásakor és tisztításakor rendszerint először elölik a tenyésztett mikroorganizmusokat valamilyen baktericid anyaggal (ez a biztonság szempontjából szükséges eljárás), majd ezután az elpusztult sejteket feltárják és ezt követi a kivonás. Ezen kezelések folyamán az előállítandó polipeptid gyakran denaturálódik és aktivitását is elvesztheti. Ezen felül ezek a kezelések aktiválhatják a sejten belüli proteázokat, amelyek gyakran elbontják a kívánt polipeptidet. Egy ismert módszer, amelyben denaturáló szerrel —ilyen a karbamid vagy a guanidin-hidroklorid — denaturált és oldatba vitt proteint izolálnak és a denaturáló szert a tisztítás folyamán eltávolítják, 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
