201771. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amikacin előállítására
HU 201771 B luor-acetülel vagy klór-acetillel vagy más megfelelő védőcsoporttal helyettesítünk. Az aminocsoportokat a 6’- és 3-helyzetben célszerűen benzil-oxi-karbonil vagy helyettesített benzil-oxi-karbonil-csoportokkal védjük, mivel — mint már említettük — ezek a csoportok a reakció végén katalitikus redukcióval könnyen eltávolíthatók. Az ilyen típusú kiinduló termékek a 855.704. sz. belga szabadalmi leírásban, vagy az 1.131.628. sz. kanadai szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint állíthatók elő. Ezután egy ilyen védett közbenső terméket vízben szuszpendálunk előre meghatározott pH-értéknél, amely 3-10 között változhat, előnyösen 4,5 és 6,5 között, majd 1-helyzetben szelektíven acilezzük az aprotikus és vízben gyengén oldódó oldószerben oldott L-HABA-sav kiválasztott, reakcióképes származékával. Az előnyösen használható szerves oldószerek közé tartoznak az alifás szénhidrogének és halogénezett vegyületek, mint például metilén-klorid, kloroform, 1,2-diklór-etán stb. A reakció 0 °C és 60 °C közötti hőmérsékleten, néhány órán át tartó keverés mellett megy végbe. A reakció befejeztével a szerves oldószert ledesztilláljuk és a 3- és 6’-helyzetben lévő védőcsoportokat hagyományos eljárások szerint eltávolítjuk. Amennyiben a találmány legelőnyösebb kivitelezésének megfelelően a védőcsoportok (esetleg helyettesített) benzil-oxi-karbonil-csoportok, ezek a szokásos katalitikus hidrogenolízissel távolíthatók el platina, palládium, palládiumoxid vagy platinaoxid katalizátor jelenlétében. Ha a védőcsoportok ftaloilcsoportok, úgy hidrazinnal végzett hidrolízissel könnyen eltávolíthatók, sőt a t-butoxi-karbonil védőcsoportok is megfelelően eltávolíthatók hangyasavval stb. Az így kapott nyersterméket azután az irodalomból ismert, amikacin tisztítására szolgáló kromatográfiai technikával tisztítjuk. A 3,6’-di-N-védett kanamicin-A találmány szerinti acilezése szabályozott pH-érték mellett és heterogén fázisban regio-szelektivitáshoz vezet, ami váratlanul igen magas, mivel amikacin képződik BB-K11 helyett, illetve az N-l- és N-3”-helyzetben történő kettős acilezésből származó termékek helyett. Ezenkívül igen lényeges az, hogy a találmány szerinti eljárás esetén a végtermékben lehetséges szennyezőként csak a BB-Kll-nek nevezett termék és az N-l- és N-3”-helyzetben diacilezett termék van jelen. Ezek toxikussága alacsonyabb, mint a BB-K29 terméké, amely az egyéb ismert szintetizálási eljárások során képződő lehetséges fő szennyező. A találmány szerinti eljárás, amely szerint kitűnő hozammal nagytisztaságú terméket kapunk, különösen biztonságos az ipari higiénia szempontjából, mivel csaknem ártalmatlan reagenseket és oldószereket használunk, és az eljárás könnyen kivitelezhető, mert nem szükséges közbenső termékeket leválasztani. Ami a találmány szerinti eljárással végzett szelektív acilezésből származó (VI) képletű reakcióterméket illeti, kémiai és fizikai tulajdonságait még 3 nem írták le, bár a 4.136.254. sz. USA-beli szabadalmi leírásban reakciótermékként említik és a már hivatkozott Tsuchiya tanulmányban le nem választott közbenső termékként szerepel. A (VI) képletű közbenső termék aminocsoportjain lévő 3 védőcsoport közvetlen eltávoh'tása helyett a közbenső termék kicsapatható a tisztítás mértékének fokozása érdekében, majd ezután a szintézis kevesebb melléktermékkel végezhető el. A találmány szerinti eljárás alapvető fontosságú közbenső termékének analitikai mérései a következő eredményeket mutatták:- teljes nitrogén Kjeldahl-módszer szerint: 7,16% (elméletileg 7,09, molekulatömeg 988,03)- potenciometriás titrálás 0,1 N HC104-gyel: az elméleti 96%-a- szabad savasság (hangyasavban kifejezve): 0,5%- szabad ammónia: nincs További kromatográfiai meghatározásokat is végeztünk a (VI) képletű közbenső terméken, mind vékonyréteg- (TLC), mind pedig nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC). A TLC körülményei a következők voltak: Merck szilikagél lemezek analitikai kromatográfiához, eluens: 125 térfogatrész kloroformból, 60 rész metanolból, 5 rész ecetsavból és 10 rész H2O- ból álló keverék. A kromatográfiatér előre telített, a lefolyás után meleg levegőárammal szárítjuk. A vizuális kimutatást (10% térfogatarányú) sósav etanolos oldatával végezzük, a teret újból meleg levegőárammal szárítjuk és ninhidrinnel bepermetezzük. Végül 5 percig kemencében tartjuk 105 °C- on. A foltok az egyes termékekre vonatkozóan, amelyek a kanamicin tetraacilátjai (a négy aminocsoportot a kiválasztott védőcsoportok blokkolják) és a kanamicin triacilátjai (ahol a harmadik védőcsoport N-l- vagy N-3”-helyzetben helyettesített, az N-3- és N-6’-helyzetű 2 csoporton kívül), rendszerint nem érik el a 2%-ot a szabvány mintával összehasonlítva. A HPLC analízist a következő feltételek mellett végezzük: oszlop: RBV-8,5 pm; 250 mm x 4,6 mm (Brownlee Laboratórium) eluens: A) KH2PO4 pufferoldat 2,5 pH-értéknél (1 liter vízben oldott 1,36 g KH2PO4 a kívánt pH-ra hozva 5% foszforsavval, 0,45 p,m szűrőn átszűrve) B) (80/20 térfogatarányú) acetonitril-pufferkeverék 2,5 pH-értéknél, átfolyási sebesség 2 ml/min grádiens: 15-90% B 15 perc alatt hőmérséklet: 30 °C detektálás: UV/350 nm származékképzéshez használt oldat: 2,46-trinitro-benzol-szulfonsav víz-piridipben (50/50). A mellékelt rajzokon az 1. ábra egy HPLC képet mutat be, míg a 2. ábra az IR spektrumot mutatja KBr-ben. Ezenkívül eszerint a szintézis képlet szerint nem képződhet az amikacin BB K29-nek nevezett izomer terméke, amely toxikusabb, mint az amikacin. Lehetséges szennyezőként csak BB-K11 fordulhat elő, valamint az N-l- és N-3”-helyzetben végzett kettős acilezésből származó termék. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
