201759. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új kondenzált diazepinonok és ezeket tartalmazó gyógyszer- készítmények előállítására
5 HU 201759 B 6 A receptorkötódési vizsgálatokhoz a szervhomogenizátumokat az alábbi arányban hígítottuk: Szív 1:400 Agykéreg 1:3000 Állkapocs alatti szövetek 1:400 A szervhomogenizátumokat ezt követően a radioaktiv ligandum meghatározott mennyiségével és a nem radioaktív vizsgálati anyag higitási sort képező mennyiségeivel Eppendorf-centrifugacsövekben 30 °C-on, 45 percen át inkubáltuk. Radioaktiv ligandumként 0,3 nM i3H]-N-metil-szkopolamint (3H-NMS) használtunk. Az inkubálási idő lejártával jéghideg puffert adtunk a mintához, majd szívatással szűrtük. A szűrőt hideg pufferoldattal átöblítettük és meghatároztuk a radioaktivitását. Az így kapott érték az összes - specifikusan és nem specifikusan kötött - 3H-NMS mennyiségét mutatja. A specifikus kötődés mértéke az 1 pM kinuklidinil-benzilét jelenlétében megkötött radioaktivitásból adódik. Minden esetben több párhuzamos mérést végeztünk. A nem radioaktív vizsgálati anyag ICso értékét grafikusan határoztuk meg. Ez a vizsgálati anyagnak azt a koncentrációját jelenti, amely a 3H-NMS specifikus kötődését a különböző szervekből nyert muszkarin receptorokhoz 50%-ban gátolja. Az eredmények az 1. táblázatban láthatók. B) A muszkarin antagonists hatás funkcionális szelektivitásának vizsgálata A muszkarin antagonists tulajdonságú hatóanyagok gátolják a külső eredetű agonisták vagy a kolinerg idegvégződéseknél felszabaduló acetilkolin hatását. Az alábbiakban megadjuk azokat a módszereket, amelyekkel a kardioszelektív muszkarin antagonists hatás behatárolható. In vivo módszerek: A vizsgálatok célja, hogy bizonyítsuk a muszkarin antagonists hatás szelektivitását. Minden olyan hatóanyaggal, amelyet az in vitro tesztek alapján kiválasztottunk, elvégeztük az alábbi vizsgálatokat: 1. M1/M2 szelektivitás patkányokon 2. Nyálelválasztást gátló hatás patkányokon 3. Az acetilkolin hólyagra, hörgőkre és szivfrekvenciára gyakorolt hatásának gátlása tengerimalacokon 1. M1/M2 szelektivitás vizsgálata patkányokon A módszert Hammer és Giachetti [Life Sciences 31, 2991-2998 (1982)] írták le. A kísérletekhez hím THOM patkányokat használtunk. A vizsgálati anyag növekvő dózisainak intravénás befecskendezését követően, 5 perc múlva vagy a jobb oldali bolygóideget ingereltük elektromosan (frekvencia: 25 Hz; impulzusszélesség: 2 msec; időtartam: 30 sec; feszültség: szupramaximális), vagy McN-A-343 0,3 mg/kg dózisát kapták a kísérleti állatok intravénásán. Meghatároztuk a bolygóideg ingerlésével kiváltott bradikardiát, valamint az McN-A-343 okozta vérnyomás-növekedést. A kísérleti vegyületnek azt a dózisát, amely a vagus ingerlésével kiváltott bradikardiát (M2), illetve a vérnyomás-növekedés mértékét (Mi) 50%-kal csökkenti, grafikusan állapítottuk meg. Az eredmények a 2. táblázatban találhatók. 2. Nyálelválasztást gátló hatás vizsgálata patkányokon A vizsgálatot Lavy és Mulder módszerével [Arch. Int. Pharmacodyn. 178, 437-445 (1969)] végeztük, miszerint 1,2 g/kg uretánnal altatott hím THOM patkányoknak a kísérleti anyag növekvő dózisait adtuk intravénásán, majd a nyálfolyást 2 mg/kg szubkután adott pilokarpinnal váltottuk ki. A nyálat szűrőpapírral itattuk fel, és a kapott folt kiterjedését 5 percenként planiméterrel meghatároztuk. A kísérleti anyagnak azt a dózisát, amely a nyál térfogatát 50%-kal csökkenti, grafikusan állapítottuk meg. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók. 3. Az acetilkolin hólyagra, hörgőkre és szivfrekvenciáva gyakorolt hatásának gátlása tengerimalacokon Altatott tengerimalacoknak a vizsgálati anyag beadását követően 10 ug/kg acetilkolint adtunk egyidejűleg mind intravénásán, mind intraartériálisan. A szivfrekvenciát testen kívüli elvezetéssel felvett elektrokardiogram segítségével, a légzési ellenállást Konzett és Rössler módszerével, a műtétileg feltárt húgyhólyag összehúzódását pedig közvetlenül regisztráltuk. Az acetilkolinnak a vizsgált szervekre gyakorolt hatását a kísérleti anyagok gátolják. A gátlás erősségét a dózis függvényében ábrázolva meghatároztuk a -log EDso értékeket, amelyeket a 3. táblázatban mutatunk be. A leirt vizsgálatokat például a következő vegyületekkel végeztük el: A=ll-[[N-metil-l2-(l-metil-pirrolidin-2-il)-etil]-amino]-acetil]-5,ll-dihidro-6H-pirido[2,3-b][l,4]benzodiazepin-6-on-hidroklorid B=11- [ [ N- Etil—[2— (l-metil-pirrolidin-2-il)-etil]-amino]-acetil]-9-klór-5,ll-dihidro-6H-pirido[ 2,3- b ][ 1,4 ] benzodiazepin-6-on 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
