201682. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes vakcina előállítására
1 HU 201 682 B 2 A malária súlyos, szeles körben elterjedt betegség, amely ellen - éveken át tartó erőfeszítések ellenére - még nem sikerült vakcinát előállítani [Science, 226,679 (1984)]. Kísérletesen már sikerült emlősöket - beleértve az embert is - védetté tenni a malária kórokozója, a Plasmodium okozta fertőzések ellen, besugárzott sporozoitokkal végzett vakcinálással [Clyde és munkatársai: Am. J. Trop. Med. Hyg. 24, 397 (1975) és Rieckman és munkatársai: Bull. WHO 57 (Supp. 1) 261 (1979)]. Yoshidaés munkatársai [Science 207,71 (1980)] ismertették, hogy a fenti védettséget - legalábbis részben - a sporozoit felületén lévő egyik proteinnel, a circumsporozoit (CS) proteinnel szembeni antitestek mediálják. A CS-proteinek ellen termelődött monoklonális antitestek in vitro semlegesítik a fertózőképességet és in vivo védik az állatot. Úgy tűnik, hogy a CS-protcinck az egyes fajokon belül erősen megőrződnek az evolúció során, de különböző fajokban erősen eltérőek. Négy Plasmodium fajt ismerünk, amelyek az embert fertőzhetik. Ezek a P. falciparum, a P. vivax, a P. ovale és a P. malariae, az utóbbi kettő sokkal ritkábban fordul elő. A tudományos érdeklődés szempontjából fontosak még a P. berghei és a P. knowlcsi, mivel ezen fajok gazdaszervezetei a rágcsálók, illetve a majmok. A P. knowlcsi CS-proteinje egy 12 aminosavból álló szekvencia 12 egymás utáni ismétlődését tartalmazza. Zavala és munkatársai [J. Exp. Med. 157,1947 (1983)] szerint az ismétlődő egység a fő immunogen a P. knowlcsi CS-protcinen, a fenti megállapítást azokra a kísérletekre alapozták, amelyek azt mutatták, hogy az ismétlődő egységek elleni antitestek blokkolják az anti-sporozoit antiszérum hozzáférhetőségét a szolubilizált sporozoit proteinhez. Gysin és munkatársai [J. Exp. Med. 160, 935 (1984)] megállapították, hogy a P. knowlcsi CS-proteinjánek egymás utáni ismétlődő egységeit képviselő szintetikus, 24 aminosavból álle peptid semlegesíti a virulens sporozoitok fertőzőképesseget majmok esetén. Colman és munkatársai (WO 84-2922-A, nyilvánosságra kerülés: 1984. 08. 02.) ismertették P. knowlcsi CS-protein ismétlődő egységét kódoló régió egy részének klónozását és béta-laktamázzal és béta-galaktozidázzal fuzionálva annak kifejeződését. Nussenzweig és munkatársai (US 4 466 917) ismertették a P44 proteinnek nevezett sporozoit proteint, cs annak klónozását és kifejeződését E. coliban. Eneaés munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 81, 7520 (1984)] is találtak egy hasonló ismétlődő egység szerkezetet P. cynomologi CS-proteinjében. Kemp és munkatársai (W084 02917-A) leírták a P. falciparum CS-proteinjének klónozását és kifejezését E. coliban. Dame és munkatársai [Science 225,593 (19C-4)] leírták a P. falciparum CS-proteinjének klónozását és kifejezését E. coliban. A protein eszerint közel 412 aminesavból áll, átlagos molekulatömege 44 000, és egy tetrapeptid 41 egymás utáni ismétlődését foglalja magában. Az ismétlődő szakaszból származó szintetikus 7-, 11 és 15-tagú peptid-töredékek kötődnek a CS-protcinnel szembeni monoklonális antitestekhez. A találmány tárgya egyrészt a Plasmodium falciparum CS-protein 16 vagy több egymás utáni ismétlődő egységét magában foglaló immunogén polipeptid, amely képes az emlős szervezet Plasmodium falciparum fertőzéssel szembeni immunitását biztosítani. A találmány tárgya másrészt eljárás az ember Plasmodium falciparum sporozoit okozta fertőzése elleni vakcina előállítására, amely hatóanyagként a találmány szerinti eljárással előállított polipeptid immunológiai védelmet biztosító mennyiségét tartalmazza, gyógyászatilag elfogadható hordozó- és egyéb segédanyagokkal összekeverve. Az la. ábra a CS-proteint kódoló szekvenciát tartalmazó P. falciparum genom DNS egy régiójának részleges endonukleázos hasításával nyert géntérképe. Az lb. ábra a pASl részleges endonukleázos hasítással nyert géntérképc. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid E. coliban előállított, 16 vagy több egymás után ismétlődő CS-protein egységet tartalmaz. Ez ugyan nem. azonos a CS-proteinnel, de tartalmazhatja a CS-prciein bizonyok* az ismétlődő egységtől eltérő részeit is. A ?. falciparum, ismétlődő egysége egy letrapeptid, amelynek szekven • ciája az alábbi:-Asn-Ala-Asn-Pro-, a képletben Asn aszparagint, Alá alanint és Pro prolint jelent. A találmány szerinti eljárással előállított polipcptidben a fenti letrapeptid variációi is előfordulhatnak, feltéve, hogy nem csökkentik 'elentőscn ?. velük szembeni antitestek reaktivitását a P, falciparum CS-protcinnel. Például Dame és munkatársai [Science 225,593 (1984)] világosan kifejtik, hogy a P. falciparum természetes CS-proteinjének 41 ismétlődő tctrapcplid egysége közül 37 szekvenciája Asn-Ala-Asn-Pro, míg 4 tetrapeptid szekvenciája Asn-Val-Asp-Pro - az utóbbi rövidítések közül Val jelentése valin és Asp jelentése aszparaginsav. A polipeptid ismétlődő egységeinek előnyösen több, mint fele úgynevezett működő szekvenciának, azaz - Asn-Ala-Asn-Pro- szekvenciának felel meg. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid előnyösen 16-112 ismétlődő egysége, tartalmaz. A találmány szerinti eljárással előállított polipeptid hibrid is lehet, vagyis ncm-CS-protcin ismétlődő egységet tartalmazó fúziós polipeptid. A fenti nem-CS-prctsir. ismétlődő szekvencia hordozó molekulaként szolgálhat, az immur.ogén tulajdonságok fokozására, vagy a rckombináns mikroorganizmusban a klónozás és exp rcsszió megkönnyítésére. Másik lehetőség, hogy a fenti kiegészítő szekvenciák más sporozoit-immunogénként, más Plasmodium-immnnogénként és/vagy más nem- Plasmodium-immunogénként szolgáló egy vagy több helyet hordoznak. A találmány csak azokra a CC-proteinekre nem vonatkozik, amelyek gyakorlatilag hasznosítható mennyiségben nem fejeződnek ki megbízhatóan E. coliban, és nem szükségesek a P. falciparum elleni immunizáláshoz. A találmány szerinti eljárással közelebbről az alábbi pol'pcptidek állíthatók elő: P.tet32 polipeptidek, amelyek legalább 15 étiddé egységet tartalmaznak, és azok C-tcrminális végéitr z a ppr.322 tetraciklin-rezisztencia (tetR) génjéből származó kb. 32 N-tcrminális aminosav kapcsolódik; F.te'Sä polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és C-terminális végükhöz egy tetR gén termék van fuzionálva; RNS 1 polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő egységet tartalmaznak, és azok C-terminális végéhez az NS1 227 aminosavja kapcsolódik; NS1R polipeptidek, amelyek legalább 16 ismétlődő 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
