201681. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyújtott hatású, növekedési hormon tartalmú parenterális alkalmazásra szánt gyógyszerkészítmények előállítására
3 HU 201 681 B 4 ban, továbbá az állatok vérhormonszintjének fokozására és fenntartására. A találmány szerinti eljárás értelmében a poliszacharid aktiválását előnyösen ciano-bromid segítségével imido-karbonát kialakításával végezzük, majd az aktivált poliszacharidot a növekedési hormonnal szobahőmérsékleten reagál tatjuk. Az eljárást az I. folyamatábra illusztrálja, ahol az aktivált poliszacharid-imido-karbonát kialakítását ciano-bromiddal végzett reakcióval, majd a növekedési hormonnal képzett adduktum kialakítását ábrázoltuk. A kapott adduklumot ezután centrifugálással izoláljuk, mossuk és szárítjuk. A kapott szilárd terméket ezután 20-70 mikron szemcseméretűre megőröljük. Meghatározzuk a nitrogéntartalmat a jelenlévő növekedési hormon százalékarányának meghatározása céljából. Az említett eljárással szarvasmarha növekedési hormonnal képzett adduktumok növekedési hormon tartalma körülbelül 60-80%. Aktivált agaróz és szarvasmarha növekedési hormon adduktuma (68% telítettség) in vitro oldási kísérletekben azt mutatta, hogy a hormon 35%-a oldódik 16 nap után. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyszerkészítmények hipofízisüktől megfosztott patkányok testi növekedését 10 napon keresztül biztosították. A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül. 1. példa Szarvasmarha növekedési hormon - aktivált agaróz adduktum előállítása 100 mg ciano-bromiddal aktivált agarózport (Sigma gyártmány, katalógusszám: Cl 150) 500 mg rekombináns technikával, a 319 049 sz. európai szabadalmi leírás szerinti módon előállított szarvasmarha növekedési hormon (bGH) 20 ml desztillált vízzel készült oldatához adjuk keverés közben, szobahőmérsékleten. A szuszpenziót 16 óra hosszat keverjük. Ezután az anyagot centrifugáljuk, a felülúszó folyadékot leöntjük és a maradékot kétszer 20 ml desztillált vízzel mossuk. A szilárd terméket szobahőmérsékleten vákuumban megszárítjuk, majd felaprítjuk és egy 0,149 mm-es lyukméretű szitán osztályozzuk. így olyan adduklumot kapunk, amelynek szarvasmarha növekedési hormon tartalma 75,4%. A fenti módon állítjuk elő az I. táblázatban felsorolt kompozíciókat. I. táblázat Szarvasmarha növekedési hormon-agaróz adduktum összetétel 2 3 4 Kiindulási anyag 500 1200 7 000 bGH (mg) Termék 1000 2400 14 000 Kitermelés (mg) 449 1371 7 000 N-analtzis 11,53 9,90 12,21 bGH (%) 74,4 64,0 78,7 2. példa Szarvasmarha növekedési hormon-agaróz adduktum oldódása Az oldási kísérletet úgy végezzük, hogy 30 ml foszfáttal pufferolt sóoldalba merített mintákat állandó hőmérsékleten rázató fürdőben tartunk. Az oldatokat periódikusan kicseréljük, és nagynyomású folyadékkromatográfiával meghatározzuk a növekedési hormontartalmat. A kísérletet 39 "C-on végezzük, pufferolt sóoldatban (NaH2P04.H20 3,45 g, Na2HP04 3,55 g, NaCl 9,5 g, 1000 ml-rc hígítva), amelyeknek pH-ja 7,4. Az 1. példa szerinti módon előállított növekedési hormon-agaróz adduktumok (68% hormontöltés) kísérleti eredményét a II. táblázat tartalmazza. II. táblázat Szarvasmarha növekedési hormon-agaróz adduktum oldódása Idó nap • Kumulatív %-os növekedési hormon leadás í. 26,6 2. 28,3 3. 31,4 6. 32,0 9. 33,0 12. 34,0 16. 35,0 19. 35,0 26. 35,2 3. példa A találmány szerinti eljárással előállított injektálható gyógyszerkészítmények hatékonysága A találmány szerinti eljárással előállított injektálható gyógyszerkészítmények hatékonyságát hipofízisüktől megfosztott patkányokon vizsgáltuk. A hipofízisüktől megfosztott patkányok nem termelnek saját növekedési hormont, és így az injektált szarvasmarha növekedési hormonokra érzékenyek. Az eredméynt egy bizonyos időn, például 10 napon belül bekövetkezett növekedés mutatja. Hipofízistől megfosztott albino patkányoknak (Taconic Farms, Sprague Dawley) az 1. példa szerinti módon előállított második gyógyszerkészítményt adagoljuk olyan mennyiségben, hogy napi 80 pg szarvasmarha növekedési hormont kapjanak 0,2 ml foszfáttal pufferolt sóoldatban, amely 2% karboxil-metil-cellulózt tartalmaz. A vizsgálat kezdete előtt az állatok testtömegét megmérjük, és ez alalpján kiválogatjuk. Azokat az állatokat használjuk, amelyeknek testtömege a standard deviáción belül van a csoport átlag testtömegéhez képest. A kapott csoportot ezután véletlenszerűen 8 állatot tartalmazó kezelési csoportokra osztjuk. A vizsgált állatokat négyesével tiszta ketrecben helyezzük el. A vizsgálat első napján megmérjük az állatok testtömegét, és a vizsgálat során naponta mérjük a testtömeg változását. A 10 napos vizsgálat végén feljegyezzük állatonként a teljes testtömeggyarapodást, az átlagos tcsttömeggyarapodást patkányonként minden vizsgálat esetén. Az eredményeket a III. táblázatban foglaltuk össze, amely 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
