201680. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású szinergetikus gyógyszerkészítmény előállítására
9 HU 201 680 A 10 1. táblázat folytatása Sejtvonal Élő L-sejtek (%) in vitro US) UR) PMA nélkül PMA jelenlétében PMAnélkül/PMA jelenlétében PMA nélkül PMA jelenlétében HPB-ALL 100 97 — 100 100 TALL-1 Monociták 96 94 — 96 96 Jlll 100 100-99 98 THP 96 80-99 98 U-937 Promyelociták 100 100 — 99 99 HL-60 96 97-99 98 2. táblázat RPMI 1640folyékony táptalaj összetétele (IX) Összetevők Koncentráció (mg/1) Szervetlen sók Ca(N03)2 • 4H20 100,00 KC1 400,00 MgS04.7H20 100,00 NaCl 6000,00 NaHCCb 2000,00 N32HPÖ4.7H20 1512,00 Egyéb komponensek D-glükóz 2000,00 glutation (redukált) 1,00 Aminosavak L-arginin (szabad bázis) 200,00 L-aszp aragin 50,00 L-aszparaginsav 20,00 L-cisztin 50,00 L-glutaminsav 20,00 L-glutamin 300,00 glicin 10,00 L-hisztidin (szabad bázis) 15,00 L-hidroxi-prolin 20,00 L-izoleucin (allo-mentes) 50,00 L-leucin (metionin-mentes) 50,00 L-lizin.HCl 40,00 L-metionin 15,00 L-fenilalanin 15,00 L-prolin(L-hidroxi-prolin-mentes) 20,00 L-szerin 30,00 L-treonin (allo-mentes) 20,00 L-triptofán 5,00 L-tirozin 20,00 L-valin 20,00 Vitaminok biotin 0,20 D-kalcium-pantotenát 0,25 kolin-klorid 3,00 folsav 1,00 i-inozitol 35,00 nikotinamid 1,00 p-amino-benzocsav 1,00 piridoxin.HCl 1,00 riboflavin 0,20 tiamin-HCl 1,00 B i2-vitamin 0,005 A találmányt közelebbről az alábbi példák segítségé- 20 vei kívánjuk ismertetni. 1. példa hTNF előállítása és koncentrálás LuklI sejtekből 5% FCS-t és 10 ng/ml PMA-t tartalmazó RPMI1640 25 táptalajban ml-enként 5 x 105 LuklI sejtet szuszpendálunk, és a tenyészetet 37 'C-on 48 órán át inkubáljuk. Ezután a sejteket centrifugálással összegyűjtjük, és 8-10 x 105 sejt/ml koncentrációban szérum-mentes, 2 nmól/1 etanol-amint tartalmazó R-ITS PREMIX-ben [5 pg/ml 30 inzulin, 5 pg/ml transzferrin, 5 ng/ml szelén szérum-pótló (Collaborative Research, Waltham Mass)] újraszuszpendáljuk és további 48 órán át inkubáljuk. A felülúszókat centrifugálással sejtmentesítjük, és -20 'C-on megfagyasztjuk. A LuklI sejtek felülúszóját PM10 memb- 35 ránnal ellátott kevert Amicon cellában koncentráljuk, majd 40 x 2,6 cm-es, 0,15 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó 0,05 mol/l-es Tris-pufferoldattal (pH 7,3) ekvilibrált DEAE-Sephadex A-50 töltetű oszlopra visszük, 5 *C-on. A fenti összetételű pufferoldattal 5 ml-es frak- 40 ciókat eluálunk. A kezdeti átfolyó frakciókban meghatározzuk a TNF-aktivitást, majd a csúcs-frakciókat összegyűjtjük. A fenti eljárással a specifikus aktivitást 25-szörösére növeljük (2-5 x 104 egység/mg protein). Az in vitro L-sejt vizsgálattal meghatározott hTNF-aktív frakciókat összegyűjtjük és Amicon cellában koncentráljuk. 1 egység TNF a protein azon mennyiségét jelenti, amely a standard in vitro TNF-vizsgálatban az L-sejtek 50%-os pusztulását okozza. Az összegyűjtött frakciókban a hTNF specifikus ak- 50 tivitása közelítőleg 1 x 103 és 1 x 10* egység/mg protein közötti tartományba esik abban az esetben, ha a sejteket magzati boíjúszérummal (FCS) kiegészített táptalajban tenyésztettük. Az összegyűjtött frakciókban a hTNF specifikus aktivitása közelítőleg 2 x 104 és 5 x 104 55 egység/mg protein közötti tartományban van abban az esetben, ha a sejteket szérum-mentes táptalajban tenyésztettük. A DEAE-oszlopon frakcionált hTNF intravénásán injektálva a fentebb ismertetett in vivo vizsgálatban 60 Meth A tumorokon vérzéses nekrózist okozott 300 pg hTNF 5 egér közül 1-ben +++ erősségű nekrózist váltott ki, míg a fennmaradó 4 állat esetén a nekrózis ++ erősségű volt. 150 pg hTNF 7 egér közül 5 állatban ++ erősségű, 2 állatban + erősségű nekrózist okozott. 75 pg 65 hTNF 5 állat közül 1 állatban -h- erősségű, 4 állatban + 6
