201680. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumorgátló hatású szinergetikus gyógyszerkészítmény előállítására
21 HU 201 680 A 22 12. táblázat folytatása I IFN konc. hTNF konc. 3. nap 5. nap I (egység/tenyészet) (egység/tenyészet) sejtszám x 105 éld sejt (%) sejtszám x 105 éld sejt (%) 250 100 0,83 3 1,20 2 125 100 0,80 3 1,23 2 62,5 100 0,80 12 1,15 2 250 50 0,875 6 1,23 0 125 50 0,85 12 1,05 2 62,5 50 0,80 16* 1,08 7* Kontroll 2,69 98 5,61 98 * Szinergizmus: 1/4 X + 1/4 Y A hTNF, hIFN, illetve a kettő kombinációjának különféle humán sejtvonalakra kifejtett hatását az alábbi eljárás szerint határozhatjuk meg. A sejteket tripszinezzük, kétszer öblítjük, és 8% FCS-t tartalmazó MÉM 20 táptalajban 4-5 x 104 sejt/lyuk koncentrációban 24 lyukú Costar lemezre visszük, majd 37 ‘C-on inkubáljuk. 16-24 órán át tartó inkubálás után a táptalajt leszivatjuk, és a sejtekhez 1 ml-es hígításban DEAE-frakcionált hTNF-et, vagy IFN-t, vagy hTNF és IFN elegyét mérjük. 25 Az összes sejtszámot - azaz az élő és elpusztult sejtek számát - a 3., 5. és 7. napon fázis-mikroszkópos eljárással határozzuk meg. A tenyészeteket az 5. napon a hTNF-et és/vagy IFN-t azonos koncentrációban tartalmazó friss táptalajjal töltjük fel. A fenti eljárással kaptuk 30 a 3-9. táblázatban ismertetett eredményeket Két anyag együtthatását, illetve a potencírozó hatást Clark fenti irodalmi helyen ismertetett módszere szerint határozzuk meg jelen esetben X a hIFN-t, Y a hTNF-et jelenti. A fokozott tumor-gátlást vagy sejt-toxicitást úgy 35 mutatjuk ki, hogy meghatározzuk az 1/4 X + 1/4 Y együttes hatását, és ha ez a negyed dózis kombinációval elért hatás összemérhető a külön-külön teljes dózisban mutatott hatással, a két faktor - jelen esetben a hTNF és hIFN - közötti szinergizmust bizonyítottnak tekintjük. 40 A szinergizmust a 10-12. táblázat eredményei bizonyítják. A sejtszám-meghatározást a fentebb ismertetett - a 4-8. táblázatban összefoglalt vizsgálatok során is használt - eljárással végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a sejtszámot csak a 3. és 5. napon határozzuk meg. 45 A szinergizmus világosan látszik abból az eredményből, hogy az 1/4 hIFN + 1/4 hTNF dózis esetén mért hatás nagyobb, mint ha a TNF-et vagy IFN-t külön-külön, teljes dózisban vizsgálnánk, a 10., 11. és 12. táblázatban közölt eredmények alapján, három humán sejtvonal ese- 50 tén. A fentiek értelmében a hTNF és hIFN, önmagában, vagy kombinációban humán tumorok és rákos rendellenességek kezelésére használható, mivel a két anyag együttes alkalmazás esetén kifejtett citotoxikus aktivitá- 55 sa nagyobb, mint bármelyiküké, önmagában. Maximális gyógyhatás elérésére a rákos betegeket nyilvánvalóan vagy a TNF és/vagy IFN termelésre kell serkenteni, vagy a fenti két anyag különböző kombinációival kell kezelni, vagy a teljesebb hatás elérése céljából a két 60 módszert váltogatni kell, illetve különböző, meghatározott sorrendet kell betartani. Ha az IFN maximális hatásához egyéb faktorok - például TNF - jelenléte is szükséges, a fenti hiány megszüntetése az IFN rákellenes hatásának növekedését eredményezheti. Az IFN fokozott hatása annak tulajdonítható, hogy a hTNF mint az immunrendszer biológiai válaszát módosító anyag működik. A gyógyászati készítményeket a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy a hIFN és hTNF hatóanyagokat 1:0,2-1:0,8 arányban egy gyógyászatiig elfogadható hordozóanyaggal és/vagy egyéb segédanyaggal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé - például steril oldattá, tablettává, bevonatos tablettává vagy kapszulává - formáljuk, a szokásos módon. Hordozó- és segédanyagként például keményítőt, tejcukrot, agyagot, zselatint, sztearinsavat vagy annak sóit, talkumport, növényi olajokat, gumikat és glikolokat használhatunk. A gyógyászati készítmények orális, enterális vagy rektális úton adagolható, vagy injektálható készítmények formájában lehetnek. Készíthetünk azonban szemcseppet vagy kenőcsöt is. A fenti gyógyászati készítményeket például úgy állítjuk elő, hogy az elegyet nedvesen granuláljuk, majd közvetlenül tablettává préseljük; vagy az elegyet kemény vagy lágy zselatinkapszulába töltjük; vagy az elegyet vízben vagy steril vizes oldatban oldjuk; vagy a kúp-alapanyagot képező zsírt megolvasztjuk és belekeverjük az elegyet; vagy a hatóanyagokat egy gumihoz vagy paraffinhoz adva kenőcsöket vagy pasztákat készítünk. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás tumorgátló hatású szinergetikus gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy humán tumornekrózis faktort (hTNF) és humán inteferont (hIFN) 0,2: 1-0,8:1 arányban a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozó- és/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverünk és gyógyszerkészítménnyé alakítunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hIFN-ként alfa-hIFN-t, béta-hIFN-t, gammahIFN-t vagy azok elegyét használjuk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hIFN-ként természetes hIFN-t használunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hIFN-ként rekombináns hIFN-t használunk. Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Szvoboda Gabriella osztályvezető Babits - Magyar Amerikai Kiadó Rl, Szekszárd
