201679. lajstromszámú szabadalom • Eljárás retrovirus-fertőzések elleni szinergista hatású gyógyászati készítmények előállítására
7 HU 201 679 B 8 zetjiik ugyanabba a betegbe, akiből a sejteket kivontuk. Ezután tumomekrózis faktort és interferont adhatunk be, a találmánynak megfelelően. A tumomekrózis faktor vagy a tumomekrózis faktor és az interferon optimális mennyiségét, valamint a betegek nyiroksejtjeinck extrakorporális kezelésénél alkalmazandó optimális körülményeket rutinszerűen határozzuk meg a betegek vúnstitere és az állapotuk javulása alapján. A találmány szerinti készítménnyel olyan személyeket kezelünk, akiknél fennáll a retrovirus fertőzés veszélye, vagy akiknél megjelennek a tényleges fertőzés tünetei. Olyan veszélyeztetett csoportok tartoznak ide, mint a homoszexuálisok, a kábítószerélvezők (akik a kábítószert intravénásán adják be maguknak), valamint azok a személyek, akik HÍV antitestekre nem vizsgált vért vagy vérkészítményeket kaptak infúzióban. A retrovirus okozta fertőzést például a következők bizonyítják: a vérsavő átalakulása HÍV elleni antitestek hatására; pozitív vérsavó-vizsgálati eredménye HIV-re nézve; az ARC-vel összefüggő tünetek vagy AIDS. Az AIDS-betegeknél esetleg kimutathatók a következő betegségek: Kaposi-szarkoma vagy más rosszindulatú megbetegedés; járulékos, mikrobák okozta fertőzés, például Pneumocystis carinii vagy szájpenész, idegkárosodás vagy cachexia (lesoványodás). A találmányt az alábbi példák segítségével részletesen ismertetjük. A példákban felhasznált interferonok rekombináns baktériumtenyészetek ismert és leírásunkban is idézett módszerekkel előállított termékei, és a tisztításuk 10® egység/mg körüli fajlagos aktivitásértékig történt. A tumomekrózis alfa-faktort szintén rekombinációval állítottuk elő, a fajlagos aktivitásuk 5xl07 egység/mg körüli volt. 1 * * 1. példa A HÍV fertőzés megelőzése Az OKT4*-pozitív humán T-sejt leukémia H9, HuT78 és U937 sejtvonalakat RPMI-1640 közegben szuszpendálva tenyésztjük 37 'C-on. Centrifugálással elválasztjuk a sejteket a tápközegtől, és friss RPMI- 1640 közegben szuszpendáljuk a sejteket lxlOYml sűrűség mellett Ehhez az újraszuszpendált tenyészethez •annyi tumomekrózis alfa-faktort és gamma-interferont adunk, hogy a koncentrációjuk 0,1 pg/ml tumomekrózis alfa-faktor és 0,1 pg/ml gamma-interferon legyen. A tumomekrózis alfa-faktor és a gamma-interferon kombinációja nem toxikus vírusfertőzés nélküli HuT78 és H9 sejtekre. A tenyészetet ezután 37 *C-on inkubáljuk 24 órán át, majd 1x10® cpm egység/ml HÍV vírust adunk hozzá. A cpm egységet a fordított transzkriptáz aktivitás alapján határozzuk meg [Hoffman, A. és munkatársai, Virology, 147, 326-335 (1985)]. Az egyes egységeket úgy kalibráljuk, hogy egy virion fordított transzkriptáz aktivitásának feleljenek meg. További inkubálást végzünk 3 napig 37 'C-on, majd megvizsgáljuk vírus antigének jelenlétét közveüen immunfluoreszcens vizsgálattal, a HÍV vírus p24 (középső) fehérjével szembeni patkány monoklón antitest és izotóppal jelzett kecske antiegér immunglobulin alkalmazásával [Kaminsky, L. és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82,5535-5539 (1985)]. A párhuzamos kísérletek eredményét az 1. táblázatban tüntetjük fel, ahol azoknak a sejteknek a százalékos mennyiségét adjuk meg, amelyek a HÍV vírus középső fehérjéjét tartalmazzák. 1. táblázat Hatóanyag Fertőzött sejtek mennyisége % HuT78 H9 U937 12 12 12 Kontroll Tumomekrózis 54 68 48 36 11 14 alfa-faktor gamma-27 34 32 18 7 8-Interferon Tumomekrózis alfa-faktor és 63 51 42 41 12 11 gamma-interferon 1 8 4 3 2 1 Az 1. táblázat adatai azt mutatják, hogy a tumomekrózis alfa-faktorral és az interferonnal együttesen végzett kezelés igen hatékonyan gátolja a HTV vírussal való fertőzést az erre egyébként érzékeny T-sejteknél. 2. példa HÍV vírussal fertőzött sejtek kezelése H9 és RPMI-1788 limfoblasztoid sejtek RPMI-1640 tápközeggcl készült, lxlOVml kncentrációjú szuszpenzióját lxlO3 cpm/ml HÍV vírus behatásának tesszük ki 1 pg/ml polibrén jelenlétében, hogy növeljük a HÍV vírussal fertőzött sejtek százalékos mennyiségét A sejteket mintegy 30 napig tenyésztjük, miközben 3-5 naponként kicseréljük a tápközeget, és körülbelül hetenként egyszer altenyészetet készítünk a sejtekből. A milliliterenként lxlO6 sejtet tartalmazó tenyészetekhez gyakorlatilag egyidejűleg adunk annyi tumomekrózis alfa-faktort és gamma-interferont, hogy a 2. táblázatban feltüntetett koncentrációkat kapjuk. A tumomekrózis alfa-faktor és a gamma-interferon kombinációi ezekben a koncentrációkban nem fejtenek ki citotoxikus hatást a vírusokkal nem fertőzött H9 és RPMI-1788 sejtekre. A tenyészeteket 27 *C-on inkubáljuk 3 napig, majd meghatározzuk az életképes sejtek százalékos mennyiségét trifánkékkel történő megfestéssel. A párhuzamos kísérletek eredményeit a 2. táblázatban mutatjuk be. (A táblázatban ND jelentése: nincs vizsgálat). 2. táblázat Életképes sejtek Hatóanyag Koncentráció mennyisége, % H9 1788 1 2 1 2 Kontroll _ 89 76 95 86 TNF-alfa 1,0 ng/ml ND ND 90 81 0,1 pg/ml 85 74 81 76 gammainterferon 1,0 ng/ml ND ND 83 84 0,1 pg/ml 85 74 80 82 TNF-alfa és gammainterferon 1,0 ng/ml ND ND 68 72 0,1 pg/ml 50 42 34 53 A 2. táblázatban bemutatott eredmények jelzik, hogy a tumomekrózis faktor és az interferon kombinációja a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
