201577. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklosporin antibiotikumok előállítására
13 HU 201577 B 14 FC« jelű táptalaj összetétele: maltóz 80 g tripkazin 40 g karbamid 2 g ammónium-szulfát 12 g nátrium-nitrát 3 g kálium-dihidrogén-foszfát 2 g kálium-klorid 0,5 g magnézilum-szulfát-viz (1 : 7) 0,5 g mangán(II)-szulfét-viz (1 : 1) 0,01 g réz( II )-szulfát-viz (1 : 7) 0,01 g vas( 11 )-szulfát-viz (1 : 7) 0,01 g 1000 ml csapvizben. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 5,2 értékre állítjuk. A beoltás után az 5 liter tenyészetet 25 °C-on 1000/perc fordulatszámmal kevertetjük, miközben óránként 300 liter levegővel áramoltatjuk át. A fermentációt 144 óráig folytatjuk. A fermentáció végén a fermentlé mikrobiológiai értékméréssel mérve 620 ug/ml ciklosporin-komplexet, nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel mérve 530 ug/ml ciklosporin A-t tartalmaz. Egy liter fermentléböl, az 1. példa szerint végezve az izolálást 305 mg ciklosporin A-hoz jutunk, amelynek fizikai jellemzői azonosak az 1. példában megadottakkal. 5. példa A Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 jelű törzs [NCAIM(P) F 001005] malátakívonat-élesztókivonat tartalmú ferdeagaron növesztett 5-7 napos tenyészetéről 5 ml 0,9%-os nátrium-klorid oldattal spóraszuszpenziót készítünk. Az 5 ml spóraszuszpenzióval 3 literes Erlenmeyer lombikban sterilezett 500 ml, az 1. példában megadott IC jelű inokulum táptalajt oltunk. A lombikot 25 °C-on malomszita rázógépen (340 fordulat/perc; 3,5 cin kitérés) 2 napig rázatjuk, majd a kapott inokulum rázott tenyészettel 10 1-es laboratóriumi fermentorban 45 percig, 121 °C-on sterilezett, 5 liter FCi jelű táptalajt oltunk be. A beoltás után a tenyészetet 25 °C-on 750/perc fordulatszámmal kevertetjük, miközben óránként 300 liter levegővel áramoltatjuk át. A tenyészethez 96 órás korban 2% külön steri- 5 lezett maltózt adagolunk és a fermentációt 144 óráig folytatjuk. Ekkor a fermentlé mikrobiológiai érték méréssel 950 ug/ml ciklosporin-komplexet, nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel mérve 845 ug/ml ciklo- 10 sporin A-t tartalmaz. A 4,8 liter leállási férmentiéből az izolálást a 2. példa szerint végezve 2,75 g ciklosporin A-L kapunk, amelynek fizikai jellemzői azonosak az 1. példában megadottakkal. 15 6. példa A Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 20 jelű törzset INCAIM(P) F 001005] malátakivonat-élesztőkivonat tartalmú ferdeagaron növesztjük 7 napon át. 2 db ferdeagai—tenyészetről 5-5 ml 0,9%-os nátrium-klorid oldattal spóraszuszpenziókat készítünk, melyekkel 25 2 db 3 literes Erlenmeyer lombikban sterilezett 500-500 ml, az 1. példában megadott IC jelű inokulum táptalajt oltunk. A lombikokat 25 °C-on malomszita rázógépen (340 fordulat/perc; 3,5 cm kitérés) 2 napig rázatjuk, 3Q majd a kapott inokulum rázott tenyészettel 15 1-es laboratóriumi fermentorban 25 percig, 121 °C-on sterilezett, 10 liter IC-jelű inokulum táptalajt oltunk. A kapott tenyészetet 25 °C-on 800/perc fordulatszámmal kevertet- 35 jük, miközben óránként 400 liter levegővel áramoltatjuk át. A fermentációt 48 óráig folytatjuk. Az így előállított tenyészet 1 literével 15 1-es laboratóriumi fermentorban 45 percig, 121 °C-on sterilezett, 10 liter FCí jelű tápta- 40 lajt oltunk be. A beoltás után a tenyészetet 25 °C-on 840/perc fordulatszámmal kevertetjük, miközben óránként 600 liter levegővel áramoltatjuk át. A fermentációt 144 óráig folytatjuk. Ekkor a fermentlé mikrobiológiai 45 értékméréssel mérve 1650 ug/ml ciklosporin-komplexet, nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel mérve 1200 ug/ml ciklosporin A-t tartalmaz. A fermentléböl a 2. példa szerint eljárva 7,80 g ciklosporin A-t különí- 50 tettünk el, amelynek fizikai jellemzői azonosak az 1. példában megadottakkal. 9
