201577. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklosporin antibiotikumok előállítására
7 8HU 201577 B termelésére szolgáló táptalajokban a fenti szén- és nitrogénforrásokon kívül ásványi sók (például kálium-klorid, magnézium-szulfát vagy kálium-dihidrogén-foszfát), nyomelemek (például réz, mangán és vas), továbbá vita- 5 minők és habzásgátlók lehetnek jelen. A találmány szerinti eljárás egy előnyös kiviteli módja szerint úgy járunk el, hogy a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében NCAIM(P) F 001005 10 számon letétbe helyezett Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 jelű törzs ferdeagar tenyészetéről készített spóra és micélium szuszpenzióval inokulum táptalajt oltunk, majd a 3 napos inokulum tenyészet 10%-ával 15 (500 ml), 5 liter termelő táptalajt oltunk, melyet 5-7 napig 25-30 °C-on, előnyösen 25 °C-on inkubálunk. A fermentáció során a pH-t 6,0 és 2,5 közötti, előnyösen 5,2 értéken tartjuk. A tenyésztést aerob körülmények 20 között végezzük élénk (750-1000/perc fordulatszámú) keverés mellett. A tenyészet levegöigénye mintegy (300-600 liter/óra). Fermentáció közben a fermentlé hatóanyag-tartalmát mikrobiológiai értékméréssel 25 és nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel (HPLC) határozzuk meg. A hatóanyag-tartalom maximumánál a fermentációt leállítjuk, és az antibiotikumot extrakciós és/vagy adszorbciós módszerek alkalmazásával ki- 30 nyerjük. A fermentlé mikrobiológiai értékmérésénél a ciklosporin A egyes fonalas gombákra gyakorolt szelektív növekedésgátlását használjuk fel. Tesztorganizmusként Aspergillus 35 niger, Aspergillus japanicus és a Curvularia lunata törzsek alkalmazhatók a legelőnyösebben [M. Dreyfuss és munkatársai: European J. Appl. Microbiol. 3, 125-133 ( 1976 ) ]. A fermentlé HPLC-s analízisére metanollal 10-sze- 40 resére hígitott minták szürletét használjuk (készülék: LKB, pumpamodell 2150, UV detektormodell 2151; mérés 220 nm-nél; oszlop BST Si-100-Cs, 7 um; oszlopmagasság 25 cm, belső átmérő 0,4 cm; eluens: acetonitril : foszfor- 45 sav-trietilamin (pH 6,8) 65 : 35 arányú elegye). Kísérleti tapasztalataink szerint az új Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 jelű törzs igen jó hozammal (1650 ug/ml koncent- 50 rációban) állít elő fótermékként ciklosporin A-t, minor komponensként ciklosporin B-t és ciklosporin C-t tartalmazó ciklosporin antibiotikum-komplexet. A ciklosporin-komplex fermentléből való 55 kinyerésére előnyösen extrakciós módszereket alkalmazhatunk. Az extrakciót megelőzően célszerű a mikroorganizmus micéliumát szűréssel vagy centrifugálással a tápközegből elkülöníteni. Az elkülönített mikroorganizmus go sejtekről célszerűen rövidszénláncú alkoholokkal, előnyösen metanollal, vagy szerves ketonokkal, előnyösen acetonnal oldhatók le a fermentáció során keletkező antibiotikumok, mig a tápkőzegben oldott ciklosporinok vízzé 1 55 nem elegyedő oldószerekkel, pl. etil-acetáttal, n-butil-acetáttal, i-butil-acetáttal, diklór-metánnal, 1,2-diklór-etánnal vagy kloroformmal, előnyösen n-butil-acetáttal vonhatók ki. Az extrakciós úton kapott nyersterméket a gomba által termelt vörös- és lila pigment anyagok szennyezik. Ez utóbbiakat aktív szénen vagy szilikagélen való adszorbeáltatással távolíthatjuk el. A fermentlében esetenként előforduló lipid jellegű szennyezéseket (pl. habzásgátlót) a nyerstermék petroléter és 10% vizet tartalmazó metanol közötti megoszlatással lehel elkülöníteni. A lipid jellegű szennyezések a petroléteres fázisba kerülnek. A vizes-metanolos fázisból a metanolt vákuumban lepároljuk, és a kapott vizes maradékot diklór-metánnal extrahálva, majd a diklór-metános kivonatot bepárolva jutunk a ciklosporint tartalmazó tisztított termékhez. A ciklosporin A-t az egyéb, kis mennyiségben képződő ciklosporin komponensektől oszlopkromatográfiás módszerekkel, valamint átkristályositással választhatjuk el. A találmány szerinti eljárás jelentős előnyökkel rendelkezik az eddig ismert eljárásokkal szemben. Ezen előnyök az alábbiakban foglalhatók össze: 1. ) Az eljárás legfőbb előnye, hogy a Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 jelzésű törzs által termelt ciklosporin antibiotikum-komplex mennyisége többszöröse az eddig ismert eljárásokkal előállítható mennyiségnek, és laboratóriumi körülmények között eléri az 1650 ug/ml-t, amelynek 72-89%-a ciklosporin A. 2. ) Az új törzs előnyős összetételben termeli a ciklosporin antibiotikum-komplexet (a komplex mintegy 85%-ban ciklosporin A-ból áll), igy a fermentlé feldolgozása a korábbi módszereknél egyszerűbben és gazdaságosabban oldható meg. Az izolált termékek szerkezetét UV, IR, ‘H-NMR és 13C-NMR spektroszkópiai vizsgálatokkal, aminosav-analízissel és HPLC módszerrel végzett összehasonlítással azonosítottuk. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákkal szemléltetjük. 1. példa A Tolypocladium varium sp. nov. CY/93 jelű törzs (NCAÎM(P) F 001005] malátakivonat-élesztókivonat tartalmú ferdeagaron növesztett 5-7 napot tenyészetéről 5 ml 0,9%-os nátriumklorid oldattal spóraszuszpenziót készítünk, és ennek 1 ml-ével oltunk 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilezett 100 ml IC jelű inokulum táptalajt, melynek összetétele a következő: 6
