201577. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklosporin antibiotikumok előállítására
1 HU 201577 B 2 A találmány tárgya eljárás a ciklosporin antibiotikum-komplexnek az (I) általános képlettel jellemezhető és komponenseinek: a ciklosporin A-nak IX jelentése a) képletű csoport], a ciklosporin B-nek IX jelentése bl képletű csoport] és a ciklosporin C-nek IX jelentése c) képletű csoport] előállítására aerob fermentációval. A komplex egyes tagjai 11 aminosavból álló ciklikus, semleges apoláris oligopeptidek, melyek csak egy vagy két aminosav alkotó elemben különböznek egymástól. Az antibiotikum-komplex komponensei közül a ciklosporin A-t és ciklosporin C-t A. Rüegger és munkatársai [Helv. Chim. Acta 59. 1075 (1976)], a ciklosporin B, D, E és G antibiotikumokat R. Traber és munkatársai [Helv. Chim. Acta 69. 1568 (1977); 879.402 sz. belga szabadalmi leírás] izolálták először egy általuk korábban Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifainak azonosított gomba (NRRL 8044) tenyészetéből. Később a szóban forgó gombatőrzs rendszertani besorolását pontosították, s azóta Tolypocladium inf latum Gams-ként jelölik az irodalomban. Jelenleg már 25 ciklosporin antibiotikum ismeretes, melyeket A-Z betűkkel jelölnek lllelv. Chim. Acta 70, 13 (1987)]. A komponensek közül hatástani szempontból legértékesebb a szelektív immunszupressziv hatású ciklosporin A. A ciklosporin először mint gyenge gombaellenes hatású antibiotikum vált ismertté, jelentős immunszupressziv hatására csak későb figyeltek fel [J.F. Boréi és munkatársai: Immunology 32, 1017 (1977)]. In vivo és in vitro kísérletek sorozatával igazolták, hogy a ciklosporin A, C és G az eddig ismert immunszupressziv gyógyszereknél specifikusabb hatóanyagok. Bebizonyosodott, hogy a ciklosporin A gátolja mind a humorális, mind a celluláris immunválaszt. Hatásmechanizmusát tanulmányozva megállapították, hogy a T sejtek proliferációját gátolja és felfüggeszti az interleukin-2 szintézisét. A ciklosporin A humán szervátültetéseknél történő gyógyászati felhasználásáról 1978-ban számoltak be. Először veseátültetésnél (R.J. Calne és munkatársai: Lancet 1978/2, 1323), és a csontvelő átültetésnél (R.L. Powles és munkatársai: Lancet 1978/2, 1327) történő felhasználását ismertették. A ciklosporin A felhasználásával megakadályozható szervátültetésnél a szerv (vese, hasnyálmirigy, máj, szív, tüdő) kilökődése és a csontvelő átültetésnél a beültetett csontvelő gazdaszervezettel szembeni ellenanyag termelése. Továbbá eredményesen alkalmazták a ciklosporin A-t egyes autoimmun betegségek (például uveitis, rheumatoid arthritis, psoriasis és myasthenia gravis) kezelésére is. A szabadalmi irodalom szerint ciklosporin-komplexet tartalmazó fermentlevek előállítására eddig az alábbi mikroorganizmus törzsek tenyészetét használták: Cylindocarpon lucidum Booth, NRRL 5760 (589 716 sz. svájci szabadalmi leírás); Tolypocladium inflatum 5 Gams, NRRL 8044 lkorábbi meghatározás szerint: Trichoderma polysporum (Link ex Pers.) Rifai, továbbá Bisset (1983) szerint szinonim a Tolypocladium niveummal; 603, 790 számú svájci szabadalmi leírás] és Fusarium solani, 10 MCI-1549, MCI-1550 (8 263 093 sz. japán kőzrebocsátási iratl. Ipari megvalósitás esetén azonban a fenti mikroorganizmus törzsekkel végzett fermentációs eljárások hátránya az, hogy a fermentációs idő hosszú (11-14 nap) 15 és a ciklosporin-komplex termelési szintje (mintegy 20-30 ug/ml), valamint a komplex fermentléböl történő kinyerésének hatásfoka (40% körüli) viszonylag alacsony. Kutatásaink során olyan mikroorganiz- 20 nuis törzseket kerestünk, amelyek felhasználásával a ciklosporin antibiotikum-komplexet vagy komponenseit magas koncentrációban és a korábbiaknál előnyösebb feltételek között lehet előállítani. Sok ezer gombatörzsre ki- 25 terjedő szűrővizsgálatunk során sikerült egy a Tolypocladium genushoz tartozó olyan mikroorganizmus törzset kiválasztanunk, amely az ismert törzseknél rövidebb idő alatt és jelentősebb mértékben bioszintetizált ciklos- 30 porin antibiotikum-komplexet, s a taxonómiai vizsgálatok során egyetlen ciklosporin-komplexet termelő gombafajjal sem volt azonosítható. Az új törzset - amely, vizsgálataink szerint a Tolypocladium genus egy új, faji 35 szinten elkülönithető taxonja - Tolypocladium varium species nova CY/93-nak neveztük el. A találmány tehát azon a felismerésen alapul, hogy az eddig nem ismert Tolypocladium varium species nova CY/93 jelzésű mik- 40 roorganizmus törzs - amelyet NCAIM 001005 számon letétbehelyeztünk a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében (Budapest) - fermentációja során igen magas koncentrációjú, ciklosporin tar- 45 talmú fermentlevet lehet kapni. A fermentlé ciklosporin A fótermék mellett kis mennyiségben ciklosporin B-t és ciklosporin C-t tartalmaz. Az általunk izolált új gombafaj rend- 50 szertani bélyegeit az ismert Tolypocladium fajok legfontosabb diagnosztikai karakterisztikáival az alábbiakban hasonlítjuk össze. A Tolypocladium genus-t 1971-ben Gams írta le, mint a talajlakó Moniliales egy új 55 nemzetségét. Jellegzetes tulajdonságai: lassú növekedés, párnaszerű fehér vagy fehéres telepek, términális és laterális, részben rövid oldalágon elhelyezkedő phialidák, melyek alapja erőteljesen duzzadt, rajta fonalszerü, 60 gyakorta ivelten hajlott nyak figyelhető meg, mely kicsiny egysejtű konidiumban (fejecske) végződik. Gams e genuson belül az alábbi 3 új fajt különböztette meg: T. geodes, T. cylindrosporum és T. inflatum. A T. goedes-nek 65 feltűnő aktinomiceta típusú földszaga van,3
