201515. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,6-difluor-benzamid előállítására mikrobiális hidrolizissel, valamint eljárás az eljárásban alkalmazható mikroorganizmus tenyészet előállítására
1 HU 201515 B 2 gén vagy levegő jelenlétében, keverés (például rázás vagy mechanikai keverés) közben szaporítjuk. A sejteket ismert módon gyűjthetjük össze, és kívánt esetben ferde agarlemezeken, fagyasztott vagy liofilizált állapotban tarthatjuk a szabadalmi eljárásban való használat előtt. A találmány szerinti eljárást célszerűen 0-37 °C hőmérséklettartományban, előnyösen 20 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten, 6 és 9 közötti, előnyösen 7-8 pH-értéken, előnyösen fénnyel való besugárzás közben hajtjuk végre. A Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmust az NCIB az alábbiak szerint jellemezte és azonosította. A vizsgálatokat 30 °C hőmérsékleten, a szaporítást Oxoid CM3 márkanevű (gyártó cég: Oxoid, US) agar-táptalajon végeztük, ha erre vonatkozóan külön megjegyzést nem teszünk. A sejt alaktani sajátságai 5 órán át 30 °C hőmérsékleten 0,75 tömeg% agart tartalmazó Oxoid CM 1 márkanevű (gyártócég: Oxoid, US) leveses táptalajon végzett szaporítás után 630-szoros nagyítással, fázis-kontraszt mikroszkóp alatt a sejtek párhuzamos oldalú, enyhén hajlott pálcikáknak látszanak, a sejtek némileg halmozódnak. A sejt gramm-pozitív; spóráit és motilitását nem figyeltük meg. A sejtkolóniák alaktani sajátságai A 3 napos szaporítás után kapott kolóniák kerek alakúak, szabályosak, ép körvonalúak. felületük lágy, opálos enyhén domború; igen halványan rózsaszínűek. átmérőjük megközelítőleg 1 mm. Szaporítás glukózt, peptont. vizet és cukrot tartalmazó táptalajon 37 °C : + nyomok 45 °C : -Kataláz : + Oxidáz, Kovács : - O-F glukóz : oxidativ. O-F glukóz vizsgálatot a Hayward és Holdgkiss [J. Gén. Mikcrobiol. 26. 133 (1961)] által leírt 1 tömeg%, szűrővel sterilizált D-glukózzal kiegészített oxidációs-fermentációs közeg alkalmazásával végeztük. A csőben elhelyzett mintát Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmussal oltottuk, és 14 napon át inkubáltuk. A Rhodococcus Sp. NCIB 12218 előnyösen tárolható ferde agarlemezeken 4 °C hőmérsékleten; vagy a sejtek elkülöníthetők pufferközegben, és alacsony hőmérsékleten, például -15 °C-on tárolhatók. Úgy találtuk, hogy a sejtek -15 °C hőmérsékleten aktivitásuk csökkenése nélkül tárolhatók. A találmány szerinti eljárást az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa Szaporításra alkalmas közeget készítünk az alábbi komponensekből: 2.0 2 K->HP04 0.2 2 M2SO4.7H2O 2.5 mg FeS04.7H20 12,5 mg CaCb.2H20 2,5 mg MnS04.3H20 1,0 g (NH4)2S04 10,0 g glükóz 5,0 2 pepton 3,0 g élesztőkivonat 3,0 g malátakivonat Ezeket a komponenseket 900 ml vízben oldjuk, 10 a pH-értéket sósav hozzáadásával 7,2-re állítjuk, és az oldatot víz hozzáadásával 1 literre töltjük. A fenti szaporító közegből 50 ml-t 250 ml-es kúpos lombikban Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmussal oltunk, és rázókészüléken 48 órán 15 át. 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A sejteket (15 percen át 20000 percenkénti fordulatszámmal. "Sorvall” márkanevű centrifuga segítségével) centrifugálással összegyűjtjük, 50 mmólos foszfátoldattal (pH 8) mossuk, ismét centrifugáljuk, 20 és 2,5 ml pufferoldatban ismét szuszpendáljuk. A szuszpenzióból egy kis mintát félreteszünk a benne lévő sejtek száraztömegének a meghatározására. A szuszpenziónak olyan mennyiségét, amely 25 számítás alapján 0,5 mg Rhodococcus Sp. NCIB 12218 száraz sejttömeget tartalmaz, a fenti pufferoldattal 1 ml-re hígítjuk. Az így kapott szuszpenziót 25 °C-on tartjuk, és 5 percig 60 wattos wolframlámpával 25 cm távolságról besugározzuk az 1 mg 30 2,6-difluor-benzonitril hozzáadása előtt. Ezután a besugárzást folytatjuk, és az elegyet a difluor-benzonitril hozzáadása után 25 °C-on tartjuk 15 percig. Ekkor mintát veszünk, amelyben gázkromatográfiás úton meghatározzuk a 2.6-difluor-benzonitrilt és a 2.6 di- 35 fluor-benzamidot, hogy a reakció előrehaladásának mértékét megállapítsuk. A kapott termék infravörös spektruma azonos az 5. példában előállított termékével. A fenti eljárást benzonitril, illetve 2.6-diklór- 40 benzonitril alkalmazásával összehasonlítás céljából megismételtük. Eredményeinket az alábbi I. táblázat tartalmazza. 45 I. táblázat Szubsztrátum Termék Termelőképesség 2,6-difluor- ' 2,6-difluor-25.5 g/g sejt/óra-benzonitril-benzamid (0.178 mól/g sejt/óra)-benzonitril-benzamid 15.6 g/g sejt/óra (0,146 mól/g sejt/óra) 2,6-diklór-2,6-diklór-0.053 2/g sejt/óra (3xlCcl mól/g sejt/óra)-benzonitril-benzamid 55 2. példa Az 1. példában lein, 400 ml szaporító közeget Rhodococcus Sp. NCIB 12218 mikroorganizmussal oltjuk, és 30 °C-on 48 órán át inkubáljuk. 60 A keletkezett sejteket összegyűjtjük és az 1. példában leírt módon mossuk, majd (440 mg száraztömeggel) 2 liter I. példa szerinti foszfát-pufferoldatban szuszpendáljuk. A sejtszuszpenziót mágneses keverővei végzett 65 keverés közben, üvegedényben. 25 °C hőmérsékleten 3
