201477. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sertések torzító orrgyulladása ellen alkalmazható, élő Bordetella bronchiseptica vakcina előállítására
HU 201477 B 1 A találmány élő Bordetella bronchseptica vakcina előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik, amely alkalmas a sertések tozító orrgyulladása által okozott betegségek megelőzésére. A torzító orrgyulladás fertőző betegség, amelyre az orrcsontokban lejátszódó sorvadás jellemző. A betegség kövekeztében az állatok fejlődése lassul, sőt gyakran meg is áll. Ilyen módon a gazdasági kár igen nagy és emiatt nem egy gazdaságban a sertéstenyésztést fel is kell számolni. A betegség kiváltásában a kedvezőtlen környezeti feltételek mellett meghatározó jelentőségűek az exotoxintermelő Bordetella bronchseptica és/vagy Pasteurella multocida baktériumtörzsek (Duncan, J.R., Ross, R.F., Switzer, W.P., Ramsey, F.K.: Am. J. Vet. Res. 27,457-644 /1966/; Pedersen, K.B., Barford, K.: Nord. Vet. Med. 34, 293-302 /1982/). A malacok fertőződése a kórokozókkal az anyakocáktól gyakorlatilag a születés utáni napokban következik be. A betegség elleni védekezés céljából a higiéniai feltételek javítása mellett a gyógyszeres kezelést, főleg pedig a vakcinázást használják széles körben (Éliás és Török: Zentralblatt für Vet. Med. B. 31, 180-188 /1984/). Magyarországon ma már forgalombanvan a 186 941 lajstromszámú szabadalmunk alapján a Bordetella bronchiseptica és pasteurella multocida törzsekből előállított elölt vakcina, amelynek alkalmazásával jó eredmények érhetők cl mind a torzító orrgyulladás, mind pedig az ennek következményeként fellépő tüdőgyulladás okozta elhullások és így a gazdasági károk csökkentésében. Ennek a vakcinának az alkalmazásakor a vérsavóban magas titerben jelennek meg agglutináló ellenanyagok, amelyek megnehezítik, nem egyszer meghiúsítják az értékes élő tenyészállatok exportját. A külföldi partner ugyanis feltételezi, hogy korábban beteg, vakcinázással rendbehozott állatok kiszállítására került sor. Az volt a célunk, hogy olyan megoldást találjunk, amellyel ezt a hátrányos látszatot ki lehet küszöbölni. Munkánk folyamatán megkíséreltünk élő, avirulens Bordetella bronchiseptica törzsekből vakcinát előállítani és megállapítottuk, hogy az általunk izolált Bordetella bronchiseptica N104 törzs - amelyet az NCAIM B (P) 001024 számon deponáltunk a Kertészeti Egyetemen (Budapest) levő Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében, 1987.11.17-én segítségével előállított vakcina kiváló eredményt biztosít. Eljárásunk folyamán liofilezett Bordetella bronchiseptica N104 törzset Wespthal-agaron 24 órán át 36-38 °C hőmérsékleten szaporítottunk. Ezt követően a tenyészetet III: fázisú immunsavóval ellenőriztük és lemosás után 7,4 pH értékű levesbe oltottuk és addig fermentáltuk 36-38 °C-on, amíg a tenyészet csíraszáma a 2xl010/ml értéket el nem érte, majd az anyagot azonnal liofilizáltuk. (A III. fázisú immunsavót - amely alkalmas a Bordetella bronchiseptica törzsek I-III. fázisainak meghatározására - magunk állítottuk elő nyulak III. fázisú Bordetella bronchiseptica törzzsel végzett tartós immunizálásával (Éliás,B. - Krüger, M.: Arch, exper. Vet. med. 42,859-866 /1988/). 2 Az ilyen módon - avirulens élő Bordetella bronchiseptica törzsből - készült vakcina orrnyálkahártyára történő alkalmazásával elérhető eredmények nagy előnye, hogy az immunválasz és a védelem abban a szervben jön létre, ahol a betegség kifejlődött volna. Az élő vakcina alkalmazásakor a vérsavóban minimális mennyiségben jelennek meg agglutináló ellenanyagok, és ezen túlmenően a vakcinázásra felhasznált baktériumtörzs 3 hét alatt még eliminálódik is az orr nyálkahártyájáról. Az élő vakcina további előnye, hogy használatával 60- 70%-os eredmények érhetők el és az elölt vakcinával együttesen alkalmazva tovább javul az elölt vakcina hatékonysága, megközelítőleg 100%-ig. Ez az alkalmazási mód tehát a sertésállományok jobb védelmét szolgálja. Az élő vakcinatörzs alkalmazási területei tehát a) törzstenyészetek, valamint az SPF (sepcific pathogene free) állományok malacainak immunizálása, valamint b) a felnőtt sertésállományok jobb védelme az élő és elölt vakcina együttes alkalmazásával. A vakcinatörzs izolálása a torzió orrgyulladás klinikai tüneteiből és kórbonctani elváltozásaitól mentes vágósertés orrnyálkahártyájáról történt, tehát természetes avirulens mutánsnak kell tekinteni, amely bakteriológiai értelemben III. fázisú. (A III. fázisú, avirulens mutáns kifejezés arra utal, hogy a genetikai átalakuláson átment törzs elvesztette virulcncia-faktorait, ezáltal emberre és állatra egyaránt veszélytelenné vált.) A bakteriológiai vizsgálatok szerint a 7,8,9,12 és 13 K antigénfaktor termelésre képes. 18 órás folyékony tápközeges tenyészete 1:64 titerben + + erősséggel agglutinálja a juhvörösvértestet, a borjú- és a ló-vörösvértesteket azonban nem. Egerek fertőzésekor (agyvelőbe, tüdőbe és hasüregbe 107,108 és 5xl08 csíraszám esetén) a törzs avirulensnek bizonyult. Egérlépben végrehajtott vizsgálat szerint a törzs nem termel exotoxint, az egerekben a 7. napra a baktérium 24 órás folyékony tápközeges tenyészete minden hígításával végzett vénás fertőzés esetén a lépben hiperplázia (1:16 hígításnál 118 mg lép/10 g egértömeg) jött létre. A törzs sertéspatogenitásának SPF malacokban orrnyálkahártyáról orrnyálkahártyára történő passzálásával végzett vizsgálata során az eredeti biológiai tulajdonságait (K-antigének, haemagglutináció, exotoxintermelés) nem változtatta meg a vakcinatörzs. A sertések orrában sem kórszövettani, sem kórbonctani értelemben nem hozott létre elváltozást. A vakcinázási kísérletek során a vakcinázott állatok orrnyálkahártyájának vizsgálatával lényegesen jobb bakteriológiai eredményeket kaptunk, mint a kezeletlen kontrollokban. A vakcinázások minden életkorban jelentősen (10-45%-kal) csökkentették a virulens pasteurella multocida fertőzöttséget, a virulens Bordetella bronchiseptica törzsek pedig a vakcinázás után 2-3 hónapig meg sem tudtak telepedni a sertések orrnyálkahártyáján. Utóbbi a vakcinázás hatására az orrnyálkahártyában képződő magas titerű (indirekt immunfluoreszcenciával 1:(200-800) a titer) szekréciós IgA (A típusú immunglobulin) hatására jön létre. Az avirulens élő Bordetella bronchiseptica vak-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
