201411. lajstromszámú szabadalom • Glutén-enteropátia kimutatására alkalmas reagens készlet és eljárás glutén -enteropátia kimutatására
1 HU 201411 B 2 A találmány tárgya glutén-enteropátia kimutatására alkalmas reagens készlet és eljárás glutén-enteropátia kimutatására. A találmány szerinti eljárással a cöliákiában és dermatitis- herpetiformisban kialakuló glutén-enteropátia gyors és nem invazív módon szülhető. A „European Society for Pediatric Gastroenterology and Nutrition” által ajánlott glutén-enteropátia szűrési módszer többszöri bél- biopszia vételéből áll. A vékonybél-biopsziával összegyűjtött rostokat mikroszkóp alatt elemzik. A beteget, leggyakrabban a természetes - anyatej - táplálásról mesterséges táplálásra áttérő gyermeket, legalább három vékonybélbiopsziának vetik alá. Ilyen biopsziát előzetes diagnózis felállítására alkalmaznak, mielőtt a gluténmentes diéta tartását javallják, majd a diéta során kontrollként, és a diagnózis végső bizonyítékaként gluténprovokáció után. Cöliákiában a glutén-enteropátia invazív diagnózisa időigényes és néhány évig tart, míg az említett diagnózis bizonyítható, vagy elvethető. A mintavétel kellemetlen a betegnek, és specialista részvételét igényli. Továbbá munka- és időigényes is a vékonybél-biopsziákból preparátumok készítése. Ugyancsak ismeretes Enterman Kp, Netkens MJ, van der Meer JB, Archív fuer Dermatologische Forschung, 1977. december 27. 260/3 , 247-52. oldalon publikált közleményéből, hogy a glutén specifikus antigénjéinek detektálása lehetetlen. A vizsgálatot herpeszes bőrgyulladással fertőzött betegek bőrében lévő inmmuno- agregátumokkal végezték. A publikáció szerint tíz herpeszes bőrgyulladással fertőzött páciens bőréből a nem megbetegedett felületeket vizsgálták arra, hogy megjelennek-e glutén antigének immunfluoreszcenciás eljárással. A vizsgálat során nyúlgliadinimmun-szérumot, humán búza antitesteket és humán retikulin antitesteket fluoreszcein-izocionáttal kombinálva és bizonyos antihumán IgA immunglobulin antitestet alkalmaztak. Valamennyi páciensnél IgA lerakódást találtak az irha szemölcs végződésin, a betegség által meg nem támadott területeken. A búza, a retikulin konjugátumok és a nyúlgliadin-immun-szérum esetén egyetlen bőrmintánál sem lehetett megállapítani specifikus immun-fluoreszenciát. Három páciens bőr-biopsziáját savas oldattal kezelték (pH=3,2) az esetlegesen keletkező antigén-antitestkomplexek disszociálása érdekében. Eluálás után a biopsziák a nem változott IgA fluoreszenciát mutatták, míg ismételt kísérletek az antibúza és antiretikulin immunitással negatív eredménnyel jártak. A bőr eluensek, amelyek közül kettő IgA-t tartalmazott, nem tartalmaztak búzával és retikulinnal szembeni antitestet. A kapott eredmények nem szolgálnak alapul ahhoz a hipotézishez, hogy a herpeszes bőrgyulladással fertőzött páciensek bőrében lévő lehetséges immunkomplex antigénje nem tartalmaz glutént. Ugyancsak ismeretes a 134 3358. számú szovjet szabadalmi leírásból egy eljárás cöliákia kimutatására. Az eljárás szerint a cöliákiát úgy diagnosztizálják, és különböztetik meg a bél krónikus gyulladásától, hogy a páciens perifériás vérlimfocitái szuszpenziójához 3,5-5,5 mg/ml fliadint és egy fluoreszcens mintát adagolnak és mérik a lumineszcencia intezitását. Ez az intezitás cöliákia esetében 3,3 és 9,7 egység közötti és krónikus bélgyulladás esetén 0,4 és 2,8 egység közötti. Az ismertetett eljárások cöliákia és herpeszes bőrgyulladás kimutatására immuno-fluoreszcenciás technikát alkalmaznak, ez egy költséges eljárás és fluoreszcenciamikroszkóp alkalmazását igényli, amellyel a preparátumok ultraibolya-fényben vizsgálhatók. A preparátumokat még aznap meg kell vizsgálni, amikor azokat elkészítik, és tartós preparátumok előállítása az eljárással nem lehetséges. A glutén-enteropátia immunológiai markerének felfedezése lehetővé teszi a glutén-enteropátia kimutatásának egy új módszerét. Ez a marker a simaizomszálcsák IgA anti-endomiziális antitestje, az IgA-EmA. Minden akut stádumú cöliákiás beteg szérumában megjelenik, eltűnik gluténmentes diéta tartásakor és megjelenik a gluténmentes diétát nem tartó betegek szérumában. Az említett antitestek a glutén-provokáció kezdetétől számított két hét és három hónap közötti időtartamon belül megjelenik. A találmány szerinti eljárást a glutén-enteropátia immunológiai kimutatására úgy végezzük, hogy a szövetpreparátumra vizsgálandó szérumot és kontroll szérumot csepegtetünk, majd a preparátumot az inkubációs idő után lemossuk. A találmány szerinti eljárásra jellemzően ezután az így előkészített szövetpreparátumra preparátumonként 40-50 pl immunológiai összetételt cseppentünk, amely peroxidázhoz kötött antihumán A-immunoglobulin állati antitestet tartalmaz, majd inkubálás után a preparátumot lemossuk, és szövetpreparátumonként legfeljebb 50 pl 3,3’-diamino-benzidin-tetrehidrokloridot vagy p-fenilén-diamint csepegtetünk a preparátumokra, amely a szövetpreparátumok elszíneződését okozza, azokon a helyeken, ahol az összetétel megkötődött, majd a szövetpreparátumot mossuk, és fénymikroszkóp alatt megfigyeljük. A találmány szerinti glutén-enteropátia kimutatására alkalmas reagens készlet tartalmaz szövetpreparátumokat, azokra felvitt kontroll szérumokat és a szérumok mosására és hígítására alkalmas szert, és jellemző rá, hogy szövetpreparátumonkén 40-50 pl immunológiai összetételt is tartalmaz, amely peroxidázhoz kötött antihumán A-immunoglobulin antitestből áll, valamint szövetpreparátumonként legfeljebb 50 pl 3,3’-diamino-benzidin-tetrahidrokloridot vagy p-fenilén-diamint tartalmaz. Ez utóbbi a szövetkészítmények elszíneződését okozza azokon a helyeken, ahol az immunológiai összetétel megkötődött. A találmány szerinti reagens készlet és eljárás segítségével glutén-enteropátia gyors kimutatása válik lehetővé, mivel a preparátumok elszíneződése egyszerű fénymikroszkóppal vizsgálható, mely minden laboratóriumban megtalálható. Ezen kívül a kapott készítmények tartósak, amennyiben glicerinnel bevonjuk őket és fedőüveget helyezünk rájuk. A találmányunkat a következőkben példákkal szemléltetjük. 1. példa A glutén-enteropátia kimutatására alkalmas reagens készlet a következőket tartalmazza: a) 11 db üveglap, a szövetpreparátumokkal b) 1 db normál üveglap 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
