201355. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kinin, kinidin és dihidro-származékaik mikrobiológiai hidroxilezésére
5 HU 201355 B 6 1. példa Kinidin hidroxilezése M. plumbeus gomba alkalmazásával Néhény csepp M. plumbeus MMP 430 spóraszuszpenziót adunk egy 250 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikban lévő 100 ml, alábbiakban leirt .A" közeghez, amelynek pH értékét 7-re állítottuk. Az inkubálást 72 órán át 27 °C hőmérsékleten forgó-keverő berendezésben végezzük, percenként 327 fordulatszámmal. Ezután 1 ml etanolban oldott 50 mg kinidint adunk a tenyészethez steril körülmények között, és a keverést 14 napon át azonos körülmények között folytatjuk, a tenyészetet celiten szűrjük, a szürletet nátrium-kloriddal telítjük, pH-értékét 2 n nátrium-hidroxid hozzáadáséval 10-12-re állítjuk, majd hatszor diklór-metánnal extraháljuk. Az egyesített szerves fázist szárítjuk, bepároljuk és a maradékot preparatív szilikagél-rétegen kromatografáljuk. Eluálószerként diklór-metán, metanol és ammónium-hidroxid 85:14:1 arányú elegyét alkalmazzuk. Azt a csikót, amely a 254 nm hullámhosszú fluereszcenciával azonosított (3S)-3-hidroxi-kinidint tartalmazza (ennek vándorlási sebessége kisebb, mint a kinidiné) lekaparjuk, és metanollal eluáljuk. Így 1 mg hozammal kapunk (3S)-3-hidroxi-kinidint, amely az autentikusan előállított mintával azonos. A nem reagált kinidint hasonló módon, csaknem kvantitatív (42 mg) hozammal visszanyerjük. Az .A" közeg összetétele: Kukoricalekvár 10,00 g Magnézium-szulfát-heptahidrát 0,50 g Kálium-klorid 0,50 g Nátrium-nitrát 2,00 g Vas-(ll)-szulfát-heptahidrát 0,02 g D-Glükóz 30,00 g Kálium-dihidrogén-foszfát 1,00 g Dikálium-hidrogén-foszfát 2,00 g Desztillált víz, amennyi szükséges 1,00 literhez. 2. példa Dihidrokinidin hidroxilezése M. plumbeus gomba alkalmazásával Az 1. példában leirt tenyészethez hasonló M. plumbeus CBS 111-07 tenyészettel az 1. példában leírt inkubálást hajtjuk végre, 1 g/liter dihidrokinidin-végkoncentrációban. így 20 nap elmúltával 5 mg hozammal kapunk (3S)-3-hidroxi-dihidrokinidint, amely az autentikus úton előállított mintával azonos, és 80 mg hozammal nyerjük vissza a dihidrokinidint. 3. példa Dihidrokinidin hidroxilezése S. rimosus baktérium alkalmazásával Néhány ml S. rimosus NRRL 2334 elötenyészetet adunk 100 ml, alább leirt .B" közeghez, amelynek pH-értékót 7-re állítottuk. A tenyésztést 72 órán át 27 °C-on végezzük, majd 1 ml etanolban oldott 100 mg dihidro-kinidint adunk hozzá, és a keverést 25 napon át azonos körülmények között folytatjuk, így hasonló módon 4 mg (3S)-3-hidroxi-dihidrokinidint kapunk, és 85 mg dihidrokinidint visszanyerünk. A .B" közeg összetétele: Bacto Casaminosavak (Difco) 5,0 g Élesztőkivonat 3,0 g D-Glükóz 30,0 g Desztillált viz, amennyi szükséges 1,0 literhez. 4. példa Kinin hidroxilezése C. echinulata gomba alkalmazásával A fentiekben leírt inkubálást hajtjuk végre .A' közeg alkalmazásával C. echinulata NRRL 3655 hasonló tenyészetével. A kinin vég koncentrációja 1 g/liter. így 30 nap elmúltával 9,5 mg hozammal kapunk (3S)—3— -hidroxi-kinint, amely azonos egy autentikusan előállított mintával, és 75 mg kinint viszszanyerünk. Megfigyeltük, hogy kis mennyiségben két további termék képződik, amelyek 254 nm hullámhosszon fluoreszkálnak. 5. példa Dihidrokinin hidroxilezése M. circinelloides gomba alkalmazásával A fentiekben leirt inkubálást hajtjuk végre .A' közegben M. circinelloides CBS 108-16 hasonló tenyészetének alkalmazásával, 1 g/liter dihidrokinin-végkoncentrációval. így 36 nap elmúltával 17 mg hozammal kapunk (3S)-3-hidroxi-dihidrokinint, amely azonos egy autentikusan előállított mintával, és 70 mg dihidrokinint nyerünk vissza. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
