201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
15 HU 201350 B 16 10"4, illetve 10'5 arányú hígításban. A 10“4 és 10'5 hígításokból 0,1 ml-t szélesztettünk LA lemezeken. Ezekről a lemezekről 50 telep ellenálló mintáját vizsgáltuk a megfelelő szelektív lemezeken (illetve 200 telepét, ha az instabilitás várhatóan gyenge volt). Az elvesztés gyakoriságát (LF érték) a következő képlet alapján számítottuk ki: LF = 1 - (7)<1/27> ahol V • jelentése a plazmidot hordozó sejtek gyakorisága, feltételezve, hogy egy telep 27 generáción keresztül nő. Ehhez a módszerhez hozzátartozik a nagy statisztikai ingadozás. III. megosztási vizsgálat: A Lac* és Lac" plazmidok stabilitásának kvantitatív mérése. Egy teljes telepet felvettünk egy szelektív lemezről, és 10s sejt/ml koncentrációban szuszpendáltuk kb. 1 ml 0,9%-os NaCl oldatban. 10'3 higitású szuszpenziókból 2 x x 0,1 ml-t használtunk 2 x 10 ml LB-tápközeg inokulálására, és az inkubálást 30 °C hőmérsékleten rázás közben hajtottuk végre. Kb. 5 • 108 sejt/ml sejtsűrűségnél a tenyészeteket lO^szeresre illetve 105-szeresre hígítottuk. 0,1 ml-t használtunk fel a lO^szeres hígításból (5 • 103 sejt), hogy inokuláljunk 10 ml friss LB tépkózeget, és 0,4 ml-t szélesztettünk a lO^szeres hígításból McConkey laktóz lemezeken, és a lemezeket 30 °C hőmérsékleten egy éjszakén ét inkubáltuk. A higulás 5 • 10® /ml-ről 5 • 102/ml-re 20 növekedési generációnak felel meg (220), így a változás a plazmidot viselő sejtek gyakoriságában az egyik hígítástól a következőig megfelel annak, amely a növekedés 20 generációja alatt történik. Általánosabban, az LF értéket a kővetkezőképpen lehet kiszámítani: \>i = (1 - LF)81 ésV 2 = (1-LF)82 aholV í ésV 2 a plazmidot viselő sejtek gyakorisága gi, illetve g2 generációk után, és LF az elvesztés gyakoriséga/sejt/generéció. Ebből az következik, hogy yx/y>2 = (1 - LF)«»-«2 és LF = 1 - (Vi/^UAsi-íZ)] Ezt a képletet használva a zéró időpontban az inokuláló sejtek számában levő ingadozás miatti hibák elkerülhetők. A képletnek egy sokkal kényelmesebb megközelítése a következő képlet: LF = ln(Vi/V2)/(gi-£2) Összeférhetetlenségi vizsgálat. Olyan plazmidokat, amelyekről azt lehetett vélni, hogy beiktatott par területet hordoznak, vizsgáltunk át azon az alapon, hogy két egyébként összeférhető replikon, amelyek ugyanazt a par területet hordozzák, összeférhetetlen egymással, és szelekciós kényszer hiányában egyik vagy másik elvész. A vizsgálatot úgy végeztük, hogy a vizsgálandó plazmidot transzformáltuk egy másik plazmidot hordozó baktériumtörzsbe, mindkét plazmidra szelektálva duplán szelektív lemezen. A duplán szelektív lemezen (két különböző antibiotikumot tartalmazó lemez) 6zélesztés után az öszszeférhetetlenség mind kvalitativan, mind kvantitatívan mérhető. A kvalitatív összeférhetetlenségi vizsgálathoz egy telepet a duplán szelektív lemezről szélesztettünk egy LA lemezen, egyedi telepeket képezve. Erről a lemezről kb. 10 telepet szuszpendáltunk 1 ml 0,9%-os NaCl oldatban, és 10'4, illetve 10-5 arányban hígítottuk. A 10'4 és 10'5 hígításból 0,1 ml szuszpenziót szélesztettünk LA lemezeken. Ezekről a lemezekről 50 telepet (vagy ha gyenge összeférhetetlenség volt várható, 200 telepet) vizsgáltunk a megfelelő szelektív lemezeken. Ha egy Lac* plazmid volt érdekelve a vizsgálatban, McConkey laktóz indikátor lemezeket használtunk a szelektív lemezeken történő replika-lemezkészítés helyett. Lac* plazmidok esetében az átvizsgálást úgy hajtottuk végre, hogy a Par* plazmidnak vélhető plazmidot transzformáltuk egy olyan törzsbe, amely már tartalmazott egy Lac* fenotípust közvetítő Par* hibrid plazmidot. A plazmid-összeférhetetlenség és következésképpen a belépő plazmid fajlagos Par* fenotípusának bizonyítása könnyen észlelhető a Lac telepekre történő átvizsgálással McConkey lemezeken, kimutatva, hogy a bent levő (rezidens) Par* plazmid destabilizálódott. Az ilyen átvizsgélési eljárást mutatunk be a 4. példában. A kvantitatív összeférhetetlenséget a Lac* plazmidok elvesztési gyakoriságának mérésével végeztük, miután a fentebb leírt heteroplazmid populáció kialakult. Az LF értékeket a korábban leírt .III. megosztási vizsgálat" szerint mértük. Genetikád technikák A baktériumok transzformációját Cohen és munkatársai szerint végeztük (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 62, 1972, 2110-2114. oldal), azzal a módosítással, hogy amikor kis transzformációs gyakoriság volt várható, a megfelelő sejtek DNS-sel történő kezelését jégen több óra hosszat végeztük, és hő-sokk után a sejteket jégben 5-30 percre ismét lehűtöttük. Ez a kezelés szignifikánsan megnövelte a transzformációs gyakoriságot. A A. bakteriofággal végzett fertőzést úgy hajtottuk végre, hogy 10 ml tenyészetet LB tápközegben, amelyet 0,2% maltózzal egé-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10
