201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
11 12 HU 201350 B lemezekről egy újabb, hasonló lemezre készített (replika lemez telepek) kimutatják a bent levő (rezidens) plazmid kiűzésének még alacsony szintjét is színtelen telepek formájában, amelyek a Lac" sejtek megjelenésére utalnak. További stabilitási vizsgálat vagy még kiterjedtebb összeférhetetlenségi vizsgálat szükséges a lehetséges par A4 hibrid plazmid tulajdonságainak vizsgálatához. Ezen az úton - a belépő és bent levő plazmidok megfelelő (összeférhető) kombinációját is beleértve - az Inc4 (Par4) fragmensek bármilyen, stabil vagy nem stabil plazmidba történő beiktatására nézve gyorsan elvégezhető az átvizsgálás. b. ) Átvizsgálás a par B4 fragmens beiktatására nézve. Mivel azt már bemutattuk, hogy két nem rokon plazmid, amelyek mindegyike hordoz par B4 területet, összeférhetetlen egymással, ugyanazt az átvizsgálás! stratégiát lehet alkalmazni a par B4 hibridek kialakításánál, mint amelyet a par A4 hibridek kialakításánál leírtunk. c. ) Átvizsgálás a par A4, par B4 fragmensek beiktatására nézve. A fenti leirás szerint lehetséges mind a par A4, mind a par B4 hibrid plazmidok kiűzése, ezen kívül azonban az EcoRl-A fragmens a Tn 5 beiktatással lehetővé teszi a par A4, par B4 fragmenseket hordozó plazmidok közvetlen szelekcióját (KmK). Így a fragmens nagy mérete ellenére még nagyon kis hibridek is könnyen szelektálhatok. Egy kisebb DNS fragmens, amely mindkét par4 területet tartalmazza, természetesen összeférhetetlenséget mutat mind a par A4, mind a par B4 plazmidok ellen. AZ ÁBRÁK MAGYARÁZATA Többször hivatkozunk az ábrákra, amelyek közül a 1-5. és 7-17. ábrák a példákban leirt plazmidok restrikciós térképét mutatják be. A 6. ábra az Rl-böl származó Pstl-D fragmens részletes (nem méretarányos) térképét mutatja, és a 18. ábra a különböző par területeket hordozó replikon különböző típusú stabilitási görbéit mutatja be a Par" replikonokkal összehasonlítva. Az 1-5. és 7-17. ábrákon a példákban leírt plazmidok lineáris restrikciós térképét mutatjuk be, amelyekben a plazmidok fenotipusát és genotípusét a vízszintes vonal fölött jelezzük, amely a szülő plazmidokat jelenti. így par A képviseli az RÍ plazmid plazmid-fenntartást biztosító területeinek egyikét, par B képviseli az RÍ plazmid másik plazmid-fenntartást biztositó területét, ice I egy gént képvisel, amely a colicin El-re való immunitást közvetíti; őri vagy őri V képviseli a plazmid-replikáció kezdetét; bla egy olyan 8 gént jelent, amely az ampicillin-rezisztenciát kódolja; IR egy fordított ismétlő szerkezetet jelent Tn 5-ön; Km® kanamicin-rezisztenciát jelent; Cm® klóramfenikol rezisztenciát jelent; 5 Ap® ampicillin-rezisztenciát jelent; Te® tetraciklin-rezisztenciát jelent; rep A egy olyan gént képvisel, amely egy, az RÍ replikációhoz szükséges fehérjét kódol; lac Z, lac Y és lac A a beiktatott lac operont jelentik, amelyek 10 közül lac Z kódolja a ß-galaktozidäzt, lac Y kódolja a permeázt, és lac A kódolja a transzacilázt; rep A - lac Z’ a rep A és lac Z gének közötti fúziót jelenti; cop B egy olyan gént jelent, amely egy olyan polipepti- 15 det kódol, amely (az RÍ plazmidok) rep A promotorjáról történő átírást visszaszorítja; cop A egy olyan gént jelent, amely egy olyan RNS molekulát kódol, amely gátolja a Rep A-RNS átírást; CI857 egy olyan gént 20 képvisel, amely egy a >4, Pb promotor-aktivitást szabályozó hőmérséklet-érzékeny Jl represszort kódol; Pdeo pedig a deo promotort képviseli. A nyilak mutatják az átírás irányét és a .háromszög '-ek mutatják a DNS-beikta- 25 tásokat. A betöltött területek és az üres területek a beiktatott géneket, a pontozott vonalak a kihagyást (deléciót) jelzik. A vízszintes vonal alatt a restrikciós enzimekhez tartozó helyeket jelöltük, amely- 30 ben E jelzi az EcoRl-t; P jelzi a Pstl-t; Bi jelzi a BamHI-t az 1. és 5. ábra kivételével, ahol a Tn 5 DNS-en kívül, az Bal I-t jelöl; Hí jelzi a Hpal-t; Ev jelzi az EcoRV-t; B2 jelzi a Bgl II—t; Sí jelzi a Sal I-t; H3 jelzi a 35 Hind III-at; és C jelzi a Cla I-et. A 6. ábrán a Pst I-D-fragmens további térképezését mutatjuk be, a vízszintes vonal fölötti számjegyek a restrikciós helyek közötti bázispárok számát jelzik. A vízszintes 40 vonal alatt a restrikciós enzimekhez szolgáló helyek vannak jelölve, ahol Rí jelentése Rsal; P Pst I-et; és Hi HPA I-et jelent. A 18. ábrán a példákban megalkotott és vizsgált Rí, pl5 és pBR 322 származékokhoz 45 tartozó stabilitási görbéket ábrázoltuk. Minden egyes görbe legalább két folyadéktenyészetnek az átlagát képviseli, amelyeket több, mint 100 generáción át folytattunk. A számokból az tűnik ki, hogy a mind a par 50 A-t, mind a par B-t tartalmazó plazmidok rendkívül stabilan öröklődnek, amely ugyanúgy igaz abban az esetben is, amikor egyedül par B-t tartalmazó plazmidokról és egyedül par A-val stabilizált mini RÍ plazmidokról 55 van szó. A Par" plazmidokhoz tartozó görbékből az tűnik ki, hogy kezdetben a plazmidhordozó sejtek gyakorisága exponenciálisan csökken, ahogyan ez el is várható az elvesztés 00 konstans sebessége miatt. A későbbi szakaszokban a plazmidhordozó sejtek gyakorisága gyorsabban csökkenőnek látszik (teljes vonallal jelölve), ami a plazmidmentes sejtek kissé gyorsabb növekedési sebességének tu- 65 lajdonitható. A szaggatott vonallal jeleztük a
