201350. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazmidok stabilizálására
19 HU 201350 B 20 1. példa Tn 5 (Kap) beiktatása az Rl-böl származó EcoRl-A fragmensbe: E. coli K 12 törzs (CSH50) sejtjeit - amelyek a pKN 184 plazmidot foglalják magukban, vagyis azt a plazmidot, amely pSF 2124 plazmidból és az RÍ plazmidból származó 19 kb hosszúságú EcoRl-A fragmensből (amely a par A és par B területeket tartalmazza) áll - az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint a^,b 211 : : Tn 5 bakteriofág szuszpenziójával fertőztünk. A 200 ug/ml kanamicint tartalmazó LA lemezeken kanamicin rezisztenciára történő szelekció után a telepeket összegyűjtöttük és öszszekevertük. A fenti keverék 1 hígításából 0,1 ml-t használtunk 100 ml LB tápközeg inokulálásához. A tenyészetet egy éjszakán át növesztettük, és a tenyészetből preparált plazmid DNS-t az E. coli K 12 törzs (CSH50) trnszformálására használtuk, 200 /ug/ml kanamicint tartalmazó lemezeken kanamicin rezisztenciára szelektálva. Ilyen módon egy pOUl plazmidot találtunk, amely a kanamicin-rezisztenciát közvetíti és amelynek van egy kb. 5 kb-nak (5000 bázispár) megfelelő fág-DNS beiktatása. A plazmid molekulatömege/mérete 34 kb, amelyet a plazmid DNS preparálásával és agaróz gélen történő analízisével mértünk, és fenotipusa a következő: Km8, ApB, Par A*, Par B*. A pOUl-ből a plazmid DNS-t kipreparáltuk és a plazmidot restrikciós enzimekkel feltérképeztük a plazmid DNS tisztításával, restrikciós enzimekkel történő elhasitásával és a keletkezett fragmensek agaróz gél elektroforézissel történő analízisével (lásd 1. ábra). Ezen a módon a pKN 184 plazmid EcoRl-A fragmensébe beiktatott-4.: •' Tn 5 fragmenst aznosítottuk mint a Km^t kódoló gén hordozóját, és a fragmens elhelyezkedését az 1. ábrában bemutatottak szerint meghatároztuk. A pOUl plazmidot további analízishez és plazmidkészítéséhez használtuk. Az E. coli CSH50/pOUl törzset a Német Mikroorganizmusok Gyűjteményében (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Grisebach strasse 8, D-3400 Göttingen), amely törzsgyűjteményt a továbbiakban DSM-nek fogunk rövidíteni, a 2712. számon helyeztük letétbe. 2. példa Par+ fragmensek klónozásához alkalmazható plazmidok készítése: A pJL 99 plazmid (Light és Molin: Mól. Gen. Genet. 184, 1981, 56-61. oldal) egy fúziót hordoz az RÍ plazmidból származó rep A gén és a lac operon között; ez a plazmid egy Lac* fenotípust közvetít. A rep A-lac fúziót 12 hordozó Pst I - Sal I fragmenst kivágtuk a pJL 99-ból és beiktattuk a pGA46-ba, amely egy pl5 replikon (An és Friesen: J. Bact. 140, 1979, 400-407. oldal), ilyen módon alkottuk meg a pJL 124 plazmidot. A plazmid térképét a 2. ábra mutatja be. A pJL 124 szintén közvetít egy Lac* fenotípust McConkey laktóz indikátor lemezeken, de úgy találtuk, hogy olyan DNS fragmens beiktatás, amelynek a pJL 124 Pst I helyén nincs vagy csak nagyon csekély promotor aktivitása \an, a rep A promotor aktivitásával olyan módon interferál, hogy ezek a hibridek már nem mutatnak Lac*-t McConkey laktóz indikátorlemezeken. A sokkal érzékenyebb X-gal indikátorlemezeken azonban a transzformáns telepek Lac* típusúak, jelezve, hogy a ű-galaktozidáz kifejeződése csökkent, de nem teljesen szorult vissza ezekben a hibridekben. Ennél fogva a pJL 124-et a Pst I fragmensek klónozására lehet használni, mivel a hibrid plazmidok könnyen kimutathatók McConkey laktóz indikátor lemezeken, mint Lac" transzformánsok. Sőt, mivel a pJL 124 egy pl5 replikon, és így nem stabil, amely könnyen kimutatható olyan sejtekként, amelyből a plazmid elveszett, igy színtelen telepeket képez laktóz indikátorlemezeken szelekciós kényszer nélkül, a pJL 124-et stabilizálni képes Pst I-et ki lehet válogatni X-gal lemezeken. A Pst I-par* fragmensek izolálásának programja így a kővetkező lépésekből áll: 1. ) A Pst I-el hasított pJL 124 összekapcsolása (ligációja) egy másik plazmidból származó Pst I fragmenssel. 2. ) Klóramfenikolt tartalmazó McConkey laktóz lemezeken transzformáció CSH 50-be. 3. ) A kiónok vizsgálata, amelyek Lac-ként jelennek meg McConkey laktóz lemezeken, a Lac* fenotípus stabil öröklődésére nézve X-gal indikátorlemezeken (lásd Anyagok és módszerek c. fejezet). Az E. coli CSH 50/pJL 124 törzset a 2760 számon helyeztük letétbe a DSM törzsgyűjteményben. 3, példa par A és par B területekkel rendelkező nem stabil plazmidok stabilizálása 1.) Mini Rl-replikon pOU 71 plazmidot (DSM 2471) - ez a plazmid a pKN 1562 plazmid .megvaduló" replikációs származéka, amely az RÍ plazmid alap-replikonját, az ED A.4 fágból származó 4^8 promotort éa cls57 represszor gént, a Tn 3 transzpozonból származó ü-laktamázt kódoló gént és egy egyedi EcoRl helyet tartalmaz (a pOU 71 megalkotásának részletesebb leírása megtalálható a jelen találmány bejelentőinek a jelen bejelentéssel összefüg-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
