201339. lajstromszámú szabadalom • Javított eljárás ciklodextrin előállítására keményítő hidrolízisével
5 HU 201339 B 6 lyeket azután izolálunk, és előnyösen az oldott anyagok maguk is alkalmasak élelmiszerben való felhasználásra, legalábbis azon az alacsony szinten, amelyen számítás szerint az izolált ciklodextrint kísérik. Azt találtuk, hogy a sók, mint oldott anyagok hatása lényegileg független a só kationjától, ami azt is jelenti, hogy a ciklodextrin termelést növelő tulajdonságok kizárólag az aniontól származnak. Ez megegyezik a ciklodextrinek ismert komplexképző hajlamával. Az alkalmazható anionok a halogenidek, elsősorban a jodid és bromid, kisebb mértékben a klorid, perklorát, tiocianót és az ötvegyértékű foszfor oxoanionjai, igy a foszfát, hidrogén-foszfát, dihidrogén-foszfát, pirifoszfát, stb. Ha a találmány szerinti eljárásban sókat használunk, akkor ezeket 0,1-2 molos koncentrációban alkalmazzuk. Etanolt használva azt találtuk, hogy 5-40 tf% koncentrációban hatásos, bár koncentrációja általában nem haladja meg a 30 tfX-ot. Más különbség, mint a találmány szerinti oldott anyag jelenléte, nincs azok között a körülmények között, amelyek között a keményítőt ciklodextrinekké hidrolizálják. így a hidrolízist általában 45-70 °C, rendszerint körülbelül 50-60 °C hőmérsékleten végezzük. A keményítő tápanyagot általában pufferoljuk, a hidrolízist 5,5-7,5 pH-értéken végezve. A keményitó hidrolízise ciklodextrinekké ciklodextrin-glikoziltranszferázzal katalizálva mindenesetre jól ismert a szakember számára és további ismertetést nem kíván. A példák, amelyeket ismertetünk, a találmány szerinti eljárást csupán szemléltetik, de semmiképpen sem korlátozzák azt. Ha más megjelölés nincs, akkor a ciklodextrin-glikoziltranszferázt Bacillus circulansból állítottuk elő. Immobilizálást típususan a kővetkező módon végezzük: 1,0 g 0-aluminium-oxidhoz (0,25/0,18 mm) 10,5 pH-értéken 10,0 ml 1,8%-os vizes polietilén-imin-oldatot adunk. Az alumínium-oxid impregnálását keverés közben szobahőmérsékleten vákuumban, 1 órán át végezzük, és ezután a polietilén-iminnel bevont hordozót kiszűrjük és szobahőmérsékleten 2 napon át levegőn szárítjuk. Ehhez a polietilén-iminnel bevont hordozóhoz 10,0 ml 5%-os vizes glutáraldehid-oldatot adunk. A feleslegben lévő folyadékot dekantáljuk, és a szilárd anyagot a feleslegben lévő glutáradlehid eltávolítása céljából ionmentesített vízzel alaposan kimossuk. A mosást addig végezzük, amíg a szűrlet fukszin-tesztje negatív, ezután 3-4-szer mossuk 1 mmólos nátrium-acetét-pufferoldattal 5,0 pH-értéken. Tisztított eiklodextrin-glikoziltranszferáz-oldat pH-értékét 1,0 mólos nátrium-acetát-oldat hozzáadásával 5,0-ra beállítjuk. A fenti módon elkészített aktivált hordozóhoz hozzáadjuk a glikoziltranszferáz-oldatot, és a keveréket éjszakán át 4 °C-on orbitális rázógépen rázzuk, a ciklus 15 mp rázás és 5 perc szünet. A feleslegben lévő folyadékot ezután dekantáljuk, és az immobilizált enzimkészítményt a hozzá tapadó, de nem kötött enzim eltávolítása céljából alaposan átmossuk, így kapjuk az immobilizált ciklodextrin-glikoziltranszferázt (1MCG). Az oldható ciklodextrin-giikoziltranszferázt egy olyan szubsztrátumot használva vizsgáljuk, amely 7,0 pP-értékü 0,2%-os oldható keményítő-oldatból áll, s ez kalcium-kloridot (5 mmól) és imidazolt (100 nuuól) tartalmaz. A 40 °C-os vízfürdőben tartott 0,30 ml szubsztrátumhoz 10 pl enzim-oldatot adunk. 10 perc múlva a reakciót 4,0 ml 0,2 m sósav hozzáadásával leállítjuk, majd a keverékhez 0,02% jódot és 0,20% kálium-jodidot tartalmazó 0,5 ml oldatot adunk. Egyidejűleg kontrollt is készítünk, 0,30 ml szubsztrátumhoz 4,0 ml 0,2 m sósavat, majd 10 ul vizsgálandó enzim-oldatot és 0,5 ml Iz-KI-oldatot adva. Ezután mérjük az abszorpciót 700 nm-en - mind a kontroliét, mind a mintáét - és az aktivitást az alábbi egyenlettel számoljuk ki: aktivitás [OD kontroll-OD minta] x 100 (egység/ml) = —.......... ■ OD kontroll x 0,01 A kontroliban és a mintában mért abszorpció különbségének 0,1 és 0,4 abszorpciós egység között kell lenni. Ha az értékek nem ebbe a tartományban esnek, akkor az enzim-oldatot: hígítjuk, és ezeket a hígításokat a számításoknál tekintetbe vesszük. 1. példa Etanol hatása Abból a célból, hogy a mikróbás szenynyeződést csökkentsük, 4 térfogat% etanolt adunk 2 tömeg% szilárd anyagot tartalmazó részlegesen hidrolizált keményítőhöz (D.E.15), amely még 5 raM kalcium-kloridot és 5 mM imidazolt is tartalmazott. Ezt, mint tápanyagot használtuk 50 °C-on egy immobilizált ciklodextrin-glikoziltx-anszferázhoz. Azonkívül, hogy a tápanyag 19 napon át szennyeződésmentes maradt, a képződött ü-ciklodextrin mennyisége 15%-ról 25%-ra növekedett. 19 nap után a katalizátor stabilitásában sem volt jelentős változás megfigyelhető. A fenti megfigyelés eredményeként vizsgálatot végeztünk arra vonatkozóan, hogy milyen hatást gyakorol az etanol a ciklodextrinek képződésére. A vizsgálatot a következőképpen végeztük: Az oldható ciklodextrin-glikoziltrunszferázhoz tápanyagként különböző mennyiségekben etanolt tartalmazó fenti tápanyagot használtunk. Mindegyik eiklodextrin mennyiségét meghatároztuk nagynyomású folyadékkroniatográfiaval, olyan körülmények között, amikor 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
