201338. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek és azokat tartalmazó gyógyászati készítmények elöállítására
7 HU 201338 B 8 5 g (17,8 mmól) Boc-(NCH3-Phe) 50 ml metilén-kloriddal és 50 ml dimetil-formamiddal képezett oldatát 0 °C-ra hűtjük, 1,8 g (9 mmól) DCC-t adunk hozzá és az elegyet 60 percen ét 0 °C-on keverjük. 5 g BHA gyantát (sztirol-1% divinil-benzol kopolimer, össznitrogéntartalom 0,56 mmól/g) 10% DIPEA metilén-kloridos oldatával 30 percen át mosunk, szűrjük és metilén-kloriddal, dimetil-formamiddal, majd metilén-kloriddal mossuk. A lehűtött elegyet a gyantához adjuk és 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A gyantát szűrjük, metilén-kloriddal, dimetil-formamiddal és izopropanollal mossuk, majd magasvákuumban szárítjuk. Az aminosav-analizis szerint a gyanta 0,20 mmól/g Boc-(NCH3-Phe)-t tartalmaz. A reagálatlan aminocsoportok lekötése céljából a gyantát 5 ml ecetsavanhidriddel és 5 ml DIPEA metilén-kloridos oldatával 60 percen át rázzuk. A gyantát szűrjük és metilén-kloriddal, izopropanollal és dimetil-formamiddal mossuk. 4,8 g (0,96 mmól), Boc-(NCH3-Phe)-t tartalmazó gyantát a fentiekben leírt szekvenciális szilárdfázisű szintézisnek vetjük alá a fent ismertetett eljárást alkalmazva, valamennyi kapcsolásnál Boc-aminosavak szimmetrikus anhidridjeit használjuk. A 16. és 20. lépésben az aktivált aminosavakat a következőképpen adagoljuk, a megfelelő reakcióidőket alkalmazva: hat különálló ciklus Boc-0- -benzil-Thr-el (1,5 g, 5 mmól, 60 perc, kétszer), Boc-Met (1,25 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-Nin-Trp(CHO) (1,7 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-Gly (900 mg, 5 mmól, 30 perc, kétszer), Boc-Met (1,25 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer) és Boc-2,6-diklór-benzil-Tyr (2,2 g, 5 mmól, 30 perc, kétszer). A Boc-védócsoport lehasítását és a gyanta acetilezését 20 ml ecetsavanhidriddel és 20 ml piridinnel metilén-kloridban végezzük 60 percig. 5,3 g, acetilezett heptapeptidet tartalmazó gyantát kapunk, amelyet 12 ml fluor-hidrogénsavval, 31 ml dímetil-szulfiddal és 4,6 ml p-krezollal 1 órán át 0 °C-on végzett kezeléssel hasítunk. Bepárlás után 42 ml vízmentes fluor-hidrogénsavat a reakcióedénybe desztillálunk, 2 órán át 0 °C-on végzett 2. kezelés céljából. Alapos elpárologtatás után a gyantát 2 térfogat etil-acetáttal mossuk, négyszer 15 ml 30%-os ecetsavval kezeljük, szűrjük és liofilizáljuk. 400 mg nyers peptidet kapunk. 140 mg nyers peptidet preparatív HPLC segítségével 2,5x50 cm-es mikronizált szilikagél-oszlopon tisztítunk, az eluálást TFA(CH3CN 5-65%) 0,022% arányű elegyével végezzük el, a csepegési sebesség 8 ml/perc. A detektálást 280 nm mellett végezzük el. A fő csúcsot összegyűjtjük és liofilizáljuk. 55 mg (16,1%) nemszulfatált peptidet kapunk. 1. példa 60 mg PAS-hez 10 ml vízmentes desztillált piridint adunk. A kapott elegyet 60 °C-on keverés közben 10 percen át melegítjük. Az oldatot lehűlni hagyjuk, majd 10 mg Ac-Tyr-Met-Gly-Trp(CHO)-Met-Thr-(NCH3-Phe)-NH2 10 ml piridinnel képezett oldatát adjuk hozzá. A reakcióelegyet egy órán át 60 °C-on keverjük, majd 2 térfogat 0,05 mólos ammónium-hidrogén-karbonát-oldattal semlegesítjük és liofilizáljuk. A termék tisztítását fordított fázisú HPLC segítségével, 10 /u részecskeátmérőjű kovasavon végezzük el; eluálószerként 0,05 mólos ammónium-hidrogén-karbonát/metil-cianid elegyet alkalmazunk. 5 mg Ac-Tyr( SO3H )-Met-Gly-Trp< CHO)-Met-Thr(S03H)-(NCH3-Phe)-NH2-t kapunk, kitermelés: 43%. UV spektrum: 0,37 mg peptid 1 ml 0,1 n kálium-hidroxid-oldatban Xmax 271 nm: £ = 5880 Xmax 278 nm: £ = 5900 Xmax 287 nm: £ = 5080 IR spektrum: mikro KBr pellet 3125 cm"1: széles OH + NH 1650 cm"1: amid és karbonil 1662 cm'1: karboxilát 1200 cm'1: szulfát 702 cm'1: fenil 2. példa 2 mg, az 1. példa szerint előállított terméket 2,0 ml 0,1 n ammónium-hidroxidban (pH 10,5) oldunk és az oldatot szobahőmérsékleten egy órán át állni hagyjuk. Az oldatot liofilizáljuk. 1,7 mg Ac-Tyr(S03H)-Met-Gly-Trp-Met-Thr(S03H)-(NCH3-Phe)-NH2-t kapunk, kitermelés: 90%. UV spektrum: 0,1 mg peptid 3 ml 0,1 n kálium-hidroxid-oldatban Xmax 271 nm: £ — 4154 Xmax 277 nm: £ = 4285 Xmax 288 nm: £ = 3692 IR spektrum: mikro KBr pellet 3396 \ j cm*1: széles OH + NH 3306 ) 1726 í 1 cm'1: amid és karbonil 1649') 1271 \ ) cm'1: szulfát 1245 ) 3. példa 4,6 g (0,9 millimól) Boc-(NCH3-Phe)-t tartalmazó gyantát készítünk és az 1. példában leírt szekvenciális szilárdfázisú szintézisnek vetjük alá. A szintézis 16. és 20. lépésében az aktivált aminosavakat az alábbi reakcióidőkkel adjuk hozzá: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
