201329. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a staurosporin metil-amino-csoportjának nitrogénatomján szubsztituált származékai és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
34 33 HU 201329 B arányú elegye). A cim szerinti vegyület 235- -240 °C-on bomlik. 51. példa N-(trifhior-acetil-amino-acetil)-staurosporin előállítása 116 mg (0t25 mmól) staurosporint 10 ml száraz kloroformban elegyítünk 43 mg (0,25 mmól) N-(trifluor-acetil)-glicinnel és 56.5 mg (0,275 mmól) diciklohexil-karbodiimiddel, és az elegyet másfél órát keverjük szobahöfokon. Hozzáadunk még 3 ml kloroformot, 43 mg (0,25 mmól) N-(trifluor-acetil)-glicint és 56,5 mg (0,275 mmól) diciklohexil-karbodiimidet, és további 14 órát keverjük szobahöfokon. A reakcióelegyet úgy dolgozzuk fel, hogy kloroformmal higitjuk, nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és telitett nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfát felett szárítjuk és bepároljuk. A maradékot kevés metilén-kloridban szuszpendáljuk, a karbamidot kiszűrjük és a szűrletet besűrités után kromatografáljuk (eluálószer metilén-klorid és etanol 98 : 2 arányú elegye). A cim szerinti vegyület olvadáspontja 190-200 °C. 52. példa N-(benziloxi-karbonil-amino-acetil)-staurospo~ rin előállítása 116 mg (0,25 mmól) staurosporint 10 ml száraz kloroformban elegyítünk 52 mg (0,25 mmól) N-(benziloxi-karbonil)-glicinnel és 56.5 mg (0,275 mmól) diciklohexil-karbodiimiddel, és az elegyet másfél órát keverjük szobahőfokon. A reakcióelegyet úgy dolgozzuk fel, hogy kloroformmal hígítjuk és nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfát felett szárítjuk és bepároljuk. A maradékot Kieselgel-en kromatografáljuk (eluálószer metilén-klorid és etanol 95 : 5 arányú elegye). A cím szerinti vegyület olvadáspontja 185- 193 °C. 53. példa N-(0-benzíl-L-szeril)-staurosporin-hídroklorid előállítása 0,2 g (0,3 mmól), a 49. példa szerint előállított N-(N’-BOC-0-benzil-L-szeril)-staurosporint feloldunk 2 ml etil-acetátban és szobahőmérsékleten elegyítjük 2 ml sósavval telített etil-acetáttal. A reakció során a cím szerinti vegyület lassan kicsapódik. 12 óra reagáltatás után az elegyet szűrjük, etil-acetáttal mossuk és nagyvákuumban szárítjuk. A termék olvadáspontja 230-235 °C. Előállíthatunk olyan gyógyszerkészítményeket is, amelyek a 43-46, példákban leirt 5 vegyületek helyett a 47-53. példák szerinti vegyületek valamelyikét tartalmazzák hatóanyagként. Kísérleti jelentés 10 1. Anyagok A vegyületeket DMSO-ban oldottuk (10 mM) és -20 °C-on tároltuk. A hígításokat 15 frissen készítettük DMSO/víz 1 : 1 arányú elegyében és a DMSO végső koncentrációja az enzim-mintában kisebb volt, mint 0,5%. Az összes alkalmazott reagenst Meyer és szerzőtársai leírták [Int. J.Cancer. 43, 851-856 20 (1989)]. 2. Módszerek PKC/protein-kináz tisztítása és vizsgálata: 25 PKC-t sertésagyvelöböl kiindulva tisztítottuk DEAE-cellulózon végzett kromatografálással, amit poliakrilamid-immobilizált foszfatidil-szerinen végzett affinitár -kromatográfia 30 követett, pontosan oly módon, ahogy azt Uchida és Filburn leírta [J.Biol.Chem., 259, 12311-12314 (1984)], és Borner és szerzőtársai [Int.J.Cancer, 40, 344-348 (1987)] módosították. Az enzim specifikus aktivitása 35 5.000 E/mg volt. A PKC aktivitás 1 egységét az enzim azon mennyiségeként definiáltuk, mint amely a gamma-[32P]-ATP 32P-jének 1 nmólját képes átvinni hiszton Hl-re 1 min/mg proteinben. 40 A PKC aktivitást lényegében a Fabbro és munkatársai által leirt [Arch.Biochem.Biophys., 239, 102-111 (1985)] módon vizsgáltuk és olyan reakciókeverékben végeztük, amely 100 m végső térfogatában, 20 mM TRISZ-HC1 45 puffert, pH = 7,4; 200 pg/ml hiszton Hl-et, 300 /uM CaClz-t, 10 mM Mg(N03)z-t, 10 /ug/ml foszfatidil-szerint, 1 jug/ml dioleint, 24 /uni ATP-t (0,25 *iCi gamma-[32p]-ATP), 2,5 E tisztított enzimet és változó koncentrációjú 50 inhibitort tartalmaz. 50 pl-es alikvot részleteket elemeztünk foszforilálási szubsztrátumra, mint azt Witt és Roskoski | Anal.Biochem., 66, 253-258 (1975)] leírta, P81 kromatografálási papírt alkalmazva. Az enzimgátlás meghagy tározását legalább 2 független kísérletben végeztük. Minden egy-pont meghatározás három párhuzamos középértéket reprezentálja, 10%-nál kisebb sztandard eltéréssel. gQ A cAMP-függó protein-kináz vizsgálata: A cAMP-függó protein-kináz elkülönítését és tisztítását dr. B.Henimings, (F.Miescher Intézet, Bázel, Svájc) végezte és a mintát gg 400 E/ml hígításban kaptuk tőle. A cAMP-54. példa 19
