201320. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 5-(2-(N-/2-amino-2-oxo-etil/-N-metil-amino)-etil)-3-hidroxi-2- /4-metoxi-fenil/-2,3-dihidro-5H-1,5-benzotiazepin-4-on-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
HU 201320 B eszközzel (Grass FT03) kapcsoltunk össze — előerősítő (Grass 7P1) útján lehetővé teszi az aortadarabok összehúzódási reakciójának regisztrálását kiíró oszcillográfon (Grass 79B). E módszer előnye — összehasonlítva spirális vagy gyűrűalakú preparátumokkal —, hogy jobban megőrzi az erek szerkezeti épségét és az összehúzódási válasznak csak a radiális komponensét, a funkcionális szempontból fontos jelenséget (artériás nyomás szabályozása) regisztrálja. A készítményekre 4 g kezdeti feszítőerőt gyakorolunk. Fenoxi-benzamint (1 pM) és propanololt (1 pM) adunk a különböző Krebs-oldatokhoz, hogy visszaszorítsuk az erek alfa- és béta-adrenerg receptorainak aktiválásával kapcsolatos összehúzódási válaszokat. A Krebs-bikarbonát-oldatban való 1 órás stabilizálódási idő után az aortákra gyakorolt terhelést 2 g-ra csökkentjük. 30 perc várakozási idő után a preparátumokat körülbelül 10 percig inkubáljuk Krebs-bikarbonát-oldatban kalcium hozzáadása nélkül, EDTA (etilén-diamin-tetraecetsav) (2000 pM) és propanolol (1 pjví) jelenlétében. Ezt az oldatot azután depolarizáló (káliumdús és nátrium-szegény), kalciummentes és propranololt (1 pM) tartalmazó Krebs-oldattal helyettesítjük. 5 perc múlva 1 mM kalciumot adunk az oldathoz és 30 perc stabilizálódási időt alkalmazunk, ami lehetővé teszi, hogy a preparátumok kontrakciója állandó szintet érjen el. Ezután a vizsgálandó vegyületek kumulatív dózisait alkalmazzuk 30 percenként (vízszintes szakasz eléréséhez szükséges idő) az 1 mM kalciummal előidézett összehúzódás teljes megszűnéséig, vagy a vizsgálandó termék 30 pM maximális koncentrációjáig. A kísérlet végén papáverin szupramaximális koncentrációját (300 pM) alkalmazzuk, majd meghatározzuk a készítmények okozta lehető legnagyobb dekontrakciót. A kezdeti kontrakció (1 mM CaCk után) és az értágító vegyületek különböző kumulatív koncentrációi utáni kontrakció abszolút értékét (grammokban) minpreparátumnál a 300 pM papáverin végső hozzáadása után 30 perc múlva észlelt minimális kontrakció különbségéből kapjuk meg. Az 1 mM kalciummal előidézett kontrakciókra vonatkoztatott %-os kontrakciócsökkenést a vegyületek minden dózisára és minden preparátumra kiszámítjuk és az egyedi dekontrakciók %-ait átlagoljuk (x ± S.E.M). A kapott átlagértékeket (súlyozva a közepes standard eltérés inverzével) szigmoid alakú matematikai modell segítségével analizáljuk, és kiszámítjuk a kalciummal indukált kontrakciót 50%-kal csökkentő mólkoncentrációt (CE50) vagy ennek antilogaritmusát (pCEso). A találmány szerinti vegyületek pCEso értékei 4,5-7 közé esnek. A találmány szerinti vegyületekkel olyan próbát is végzünk, amely a „PAF” (platelet activating factor) specifikus kötődésének gátlását mutatja ki. A kísérleti állatok 2,5-5 kg súlyú nyulak, amelyeket nátrium-pentobarbitállal (0,25 mg/kg, iv.) elaltatunk és a gégébe bevezetett cső segítségével mesterségesen lélegeztetünk. A nyaki verőérből vért veszünk és citrátos véralvadásgátlót tartalmazó csövekben gyűjtjük össze. A csöveket 15 percig 9 100 x g-vel centrifugáljuk, a vérlemezkékben dús plazmát 150 mM NaCl-ot és 2 mM EDTA-t tartalmazó 2 térfogat 10 mM trisz-HCl pufferrel (pH 7,4) hígítjuk (A-puffer). 10 percig 4 9C-on 1000 x g-vel centrifugáljuk, majd az üledéket 2 térfogat A-pufferrel mossuk, és újra centrifugáljuk. A vérlemezkékben gazdag csapadékot jéghideg pufferben (5 mM MgCh-ot és 2 mM EDTA-t tartalmazó 10 mM trisz-HCl, pH 7,0) szuszpendáljuk, homogenizáljuk és 4 °C-on 10 percig 30.000 x g-vel centrifugáljuk. E műveletet megismételjük, a kapott üledéket a fenti pufferben szuszpendáljuk, homogenizáljuk és a membránszuszpenziót folyékony nitrogénben lefagyasztjuk. A kötődés gátlásának vizsgálata céljából a szuszpenziót felolvasztjuk és pufferrel olyan mértékben hígítjuk, hogy fehérje tartalma körülbelül 150 pg/ml legyen. A membránszuszpenzió alikvotjait (30 pg fehérje) 10 mM MgCb-ot és 0,25 térfogatszázalék borjúszérum-albumint tartalmazó 10 mM trisz-HClpuffer (pH 7,0) jelenlétében 2 óráig 25 °C-on 1 nM triciált PAF-fal (3H-l-0-hexadecil-2-acetil-sn-gliceril-3-foszforil-kolin) inkubáljuk 1 ml végtérfogatban. Az inkubálás végén a membránokat összegyűjtjük és Whatman-szűrőkön gyorsan jéghideg pufferrel mossuk, vákuumszivattyúval összekötött „Skatron” sejtkollektort használva. A szűrőket megszárítjuk és radioaktivitásukat folyadékszcintillációs spektrométerben lemérjük. A specifikus kötődést a membránok 1 pM triciált PAF jelenlétében és távollétében mért radioaktivitásainak különbsége alapján határozzuk meg. A kötődés gátlását a leírt körülmények között vizsgáljuk, a vizsgálandó vegyületeket különböző koncentrációkban alkalmazva. Ezután minden vegyületnél meghatározzuk a CI50 koncentrációt (a specifikus kötődést 50%-kal csökkentő koncentráció), a gátlási görbét a legkisebb négyzetek módszere szerint ábrázolva. E próbában a találmány szerinti vegyületek CI50 értéke 1-6 pM közé esik. Végül a találmány szerinti vegyületekkel olyan próbát is végzünk, amely a „PAF-acéter”-rel [l-O(Ci6-Ci8-alkil) -2-acetil-sn-gliceril-3 -foszforü -kohn] indukált vérlemezke-agregációra gyakorolt gátló hatásuk kimutatására alkalmas. A próbát Born [J. Physiol. 168,178-195 (1963)] módszerével hajtjuk végre nyúl-vérlemezkéken. Szív-punkció útján vért veszünk és 3,8%-os nátrium-citrátot tartalmazó csövekben gyűjtjük össze [1 térfogat véralvadásgátló/9 térfogat vér], A vért 10 percig 250 x g-vel centrifugáljuk, elválasztjuk a vérlemezkedús plazmát és meghatározzuk a vérlemezkék számát. A csapadék ismételt centrifugálása után (15 perc, 3600 x g) vérlemezkékben szegény plazmát kapunk. A vérlemezkedús plazmát a vérlemezkékben .szegény plazmával hígítva milliliterenként 2.105—3.KT vérlemezkét tartalmazó szuszpenziót kapunk. In vitro agregációt maximális reverzibilis reakciót adó PAF-acéter koncentráció alkalmazása útján (általában 15-3,3 ng/ml) idézünk elő. Agregométer segítségével meghatározzuk az optikai sűrűség változását (küvettánként 300 pl vérlemezkedús plazma, 1100 for dulat/perc, 37 CC) a maximá10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
