201117. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fenil-(2,3-epoxi-1-propil)-éterek sztereospecifikus előállítására
15 HU 201117 B 16 gépen 37 °C-on 250 ml allil-[4-(2-metoxi-etil)-fenilj-éterrel és 50 mg glükózzal. A glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter képződését diklór-metánnal végzett extrakció után gázkromatográfiával követjük nyomon (az előbbi példákban leirt körülmények között). Az inkubációs elegyben a glicidil-[4-(2-metoxi-etil)-fenil]-éter koncentrációja hat óra múlva 7,30 g/liter. 13. példa 4-(2-Ciklopropil-metoxi-etil)-fenil-allil-éter átalakítása Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 törzzsel {+)-4-(2-ciklopropil-metoxi-etilhfenil-glicidil-éterré Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 0,5 g/1 dietoxi-metánt tartalmazó, 100 ml PSX ásványi sós közegben (pH = 7,0) 7,5 g/1 glicerinen 30 °C-on tenyésztett 24 órás biomasszáját 10 ml PSX közeget (pH = 7,5), 5 g/1 glükózt és 25 g/1 4-(2-ciklopropil-metoxi-etil)-allil-étert tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lorabikba töltjük. A lombik tartalmát 30 °C-on körkörös rázógépen inkubáljuk, és mintákat veszünk, amelyeket diklór-metánnal való extrahálás utón Varian 3400 gázkromatogrófon analizálunk (oszlop: 3% OVI WHP 100-200-on; 50 cm hosszú; 2 mm átmérő; 100- -tól 170 °C-ig 10 °C/perc; N2 30 ml/perc). PSX közeg: 8,92 g/1 kálium-dihidrogén-foszfát, 2,94 g/1 dinátrium-hidrogén-foszfát, 1,0 g/1 diammónium-hidrogén-foszfát, 0,2 g/1 ammónium-szulfát, 0,2 g/1 kálium-klorid, 0,294 g/1 trinátrium-citrát, 0,005 g/1 kalcium-szulfát-dihidrót, 0,2 g/1 magnézium-szulfát-heptahidrát és 10 ml/1 PS II nyomelem oldat (PS II nyomelem oldat összetétele: 0,25 g/1 ammónium-szulfát-vas-szulfát-hexahidrót, 0,05 g/1 cink-szulfát-heptahidrát, 0,03 g/1 mangán-klorid-tetrahidrát, 0,015 g/1 réz-szulfát-pentahidrát, 0,015 g/1 kobalt-klorid-hexahidrát, 0,005 g/1 bórsav, 0,0055 g/1 nátriura-molibdenát-dihidrát, 0,01 g/1 kólium-jodid és 3 pH-ig sósav). A (+ )-4-( 2-ciklopropil-metoxi-etil )-fenil-glicidil-éter termék három órás inkubálás után jelenik meg, és 24 óra alatt 3,03 g/1 koncentrációra dúsul. Megfelelő mennyiségű (+)-4-(2-ciklopropil-metoxi-etil)-fenil-glicidil-éter feldúsítására az előbb leírt körülmények között hat óra hosszat, de 37 °C-on inkubált 10 x 10 ml-es tenyészeteket 500 ml diklór-metánnal extraháljuk. A kivonatot nátrium-szulfáton szárítjuk, az oldószert elpárologtatjuk, és az epoxidot kovasavgélen hexán és éter elegyével gradiens eluéláesal (az epoxid 45-60X éterrel eluálható) tisztítva 188 mg ( + )-4-(2-ciklopropil-metoxi-etil)-fenil-glicidil-étert kapunk. (ofJ^D = +1,8° (c = 1,0, kloroformban). A termék PMR spektruma megfelel a kívánt szerkezetnek, és azonos a kémiai szintézissel előállított 4-(2-ciklopropil-metoxi-etil)-fenil-glicidil-éter spektrumával. A termék optikai tisztaságát enantiomerjeinek királis HPLC oszlopon (Daicel chiralcel OD; 25 cm x 4,6 mm; mozgó fázis: hexán, 2- -propanol és dietil-amin 800:200:1; 0,6 ml/perc, UV-detektálás 254 nm) való elválasztásával határozzuk meg. A kémiai szintézissel előállított 4-(2-ciklopropil-metoxi-etil)-fenil-glicidil-éter elemzése két, körülbelül egyenlő intenzitású csúcsot mutat a racemátnak megfelelően. A Pseudomonas oleovorans alkalmazásával előállított minta csak egy kimutatható csúcsot mutat, amely a kémiai szintézissel készített minta egyik csúcsának felel meg. 14. példa (4-Metoxi-fenil)-allil-éter átalakítása (+j-(4- -nietoxi-fenil)-glicidil-éterré Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 törzzsel. Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 0,5 g/1 dietoxi-metánt tartalmazó, 100 ml PSX ásványi sós közegben (pH = 7,0) 7,5 g/1 glicerinen 30 °C-on tenyésztett 24 órás biomasszáját 10 ml PSX közeget (pH = 7,5), 5 g/1 etanolt és 25 g/1 (4-metoxi-fenil)-allil-étert tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba töltjük. A lombik tartalmát 37 °C-on körkörös rázógépen inkubáljuk, és mintákat veszünk, amelyeket diklór-metánnal extrahálunk a 13. példában ismertetett módon végzett gázkromatografálás előtt. A (+)-(4-metoxi-fenil)-glicidil-éter termék egy órás inkubálás után jelenik meg, és 4 óra alatt 0,57 g/1 koncentrációra dúsul. Megfelelő mennyiségű (+)-(4-metoxi-fenil)-glicidil-éter feldúsitására az előbb leírt körülmények között három óra hosszat, de 2 literes lombikokban inkubált 6 x 87 ml-es tenyészeteket 780 ml diklór-metánnal extraháljuk. A kivonatot nátrium-szulfáton szárítjuk, az oldószert elpárologtatjuk, és az epoxidot kovasavgélen hexán és éter elegyével gradiens eluálással (az epoxid 30-35% éterrel eluálható) tisztítva 190 mg (+)-(4-metoxi-fenil)-glicidil-étert kapunk. [oC]25d = +4,1° (c = = 1,0, kloroformban). A termék tömeg- és PMR spektruma megfelel a kívánt szerkezetnek, és azonos a kémiai szintézissel előállított (4-metoxi-fenfl)-glicidil-éter spektrumával. A termék optikai tisztaságát enantiomer-. jeinek királis HPLC oszlopon a 13. példában leirt módon való szétválasztásával határoztuk meg, de mozgó fázisként hexán, 2-propanol és dietil-amin 900:100:1 arányú elegyét használtuk. A kémiai szintézissel előállított (4-metoxí-fenil)-glicidil-éter elemzése két, körülbelül egyenlő intenzitású csúcsot mutat a racemátnak megfelelően. A Pseudomonas oleovo-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
