201117. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fenil-(2,3-epoxi-1-propil)-éterek sztereospecifikus előállítására
11 HU 201117 U 12 példában megadottakkal azonosak, azzal az eltéréssel, hogy a hőmérséklet-program 50 “C-100 °C-ig 10 °C/perc-nél). Egy 2,25 literes térfogatú kétfázisú rendszert használunk a fenil-glicidil-éter előállításához. Az átalakítást 750 ml sejtszuszpenzióval (6,9 g/liter szárazsúly) és 1500 ml 2,5 térf./térf% allil-fenil-étert tartalmazó izooktánnal töltött fermentorban hajtjuk végre (lásd 4. ábra). Az epoxid 193 umól/óra/g száraz súly (0,03 g/óra/g száraz súly) sebességgel termelődik, és 10 óra múlva szilikagélen végzett kromatográfiával különítjük el, majd desztillációval tisztítva 750 mg (+)-fenil-glicidil-étert kapunk. A mikrobiológiai úton előállított (+)-fenil-glicidil-éter protonmágneses rezonanciaspektruma és tömegspektruma egyezik a megfelelő szerkezettel, és azonos fenil-allil-éter m-klór-perbenzoesavval való reagáltatásával kémiai úton előállított (±)—fenil—gli— cidil-éter spektrumával. A ( + )-fenil-glicidil-éter fajlagos forgatóképessége: [oC)25d = +11,38» (c = 1,09; etanol). Az optikai tisztaságot Eu(hfc)3 europium shift-reagens jelenlétében az 1. példában leírtakhoz hasonlóan protonmágneses rezonanciaspektroszkópiával vizsgáljuk. A shift-reagens hozzáadására az egyes geminális protonoktól származó jelek burkoló görbéje a kémiailag szintetizált (±)-fenil-glicidil-éterben lefelé tolódik, és mindegyik két egyenlő intenzitású jelsávra hasad fel, míg a mikrobiológiailag előállított (+)-fenil-glicidil-éterben lévő geminális protonoktól származó jelek sávja 6,7:1 arányban hasad fel. Ez az eredmény azt jelzi, hogy a molekulák 87%-a van az egyik enantiomer formában, ami 74%-os optikai tisztaságnak felel meg. A mikrobiológiai és kémiai forrásból származó epoxidok keverékének analízise olyan jelarányt ad, ami azt tanúsítja, hogy a ( + )-fenil-glicidil-éter 90%-a van az egyik enantiomer formában, ami 80%-os optikai tisztaságot jelent. A (+)-fenil-glicidil-óter optikai tisztaságának további vizsgálatát (-)-3-fenoxi-l-(izo~ propil-amino)-2-propanollá való átalakítása után végezzük el. 300 mg (+)-fenil-glicidil-étert (a 2. példában leírtak szerint) izopropil-aminnal reagáltatva 125 mg (-)-3-fenoxi-l-(izopropil-amino)-2-propanolt kapunk, amelynek olvadáspontja 42-44 °C; [oC]25d = -6,51° (c = 0,984; etanol). Hasonlóképpen szintetizálunk (±)-3-fenoxi- l-(izopropil-amino )-2-propanolt (± )-fenil-glicidil-éterből. A (-)-3-fenoxi-l-(izopropil-amino)-2-propanol protonmágneses rezonanciaspektruma és tömegspektruma (5. és 6. ábrák) és a (±)-3-fenoxi-l-(izopropil-amino)-2-propanol hasonló spektrumai (itt nem ábrázoljuk) egyeznek a megfelelő szerkezettel. Optikai tisztaságot a megfelelő S-leucil-diasztereomer származékok nagyhatékonyságú folyadékkronuitográfiájával mérünk (mint a 2. példában) és 80%-nak határozzuk meg. 9. példa (4-Allil-oxi-í'enilJ-acetamid átalakítása Pseudomonas oleovorans ATCC 29347-teJ 1+)~14~ -(2,3-epoxi-propoxi)-fenil]-acetamiddá, majd ennek átalakítása (-)-3-(izopropil-amino)-l-[4-(karbanioi]-melil)-fenoxi]-2-propanollá, (-)-ALenolol-lá. Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 szuszpenziót készítünk (0,75% nátrium-lak tátot és 0,05% dietoxi-metánt tartalmazó PSX ásványi sós táptalajon, pH 7-en, 30 °C-on 24 óra hosszat tenyésztett) sejtek 7,5 pH-jú PSX táptalajban az eredeti sejttenyészet térfogata egytizedének megfelelő térfogatra való reszuszpendálásával. A PSX táptalaj 8,92 g/liter kálium-dihidrogén-foszfátot, 2,94 g/liter dinátrium-hidrogén-foszfátot, 0,2 g/liter ammónium-szulfátot, 0,2 g/liter kálium-kloridot, 0,294 g/liter trinátrium-citrátot, 0,005 g/liter kaleium-szulfát-dihidrátot, 0,2 g/liter magnézium-szulfát-heptahidrátot és 10 ml/liter PS II nyomelem oldatot tartalmaz. A PS II nyomelem oldat összetétele: 0,25 g/liter vas(II)-diammónium-szulfát-hexahidrát, 0,05 g/liter cink-szulfát-heptahidrát, 0,03 g/liter mangán(II)-klorid-tetrahidrát, 0,015 g/liter réz(ll)-szulfát-pentahidrát, 0,015 g/liter köbalt(Il)-klorid-hexahidrát, 0,005 g/liter bórsav, 0,0055 g/liter nátrium-molibdenát-dihidrát, 0,01 g/liter kálium-jodid, sósavval pH 3,0-ra állítva. Egy 2,5 literes Erlenmeyer-lombikban 1100 ml sejtszuszpenziót rázóasztalon 30 °C-on 3,3 g 4-(allil-oxi-fenil)-acetamiddal inkubálunk, amelyet 5% Tween-80-at tartalmazó vízzel golyósmalomban készített 10%-os szuszpenzióként adunk a sejtszuszpenzióhoz. Az inkubált elegyet 72 óra múlva 1000 ml diklór-metánnal extraháljuk, az oldatot megszárítjuk, majd bepároljuk. Utána a maradékot acetonból átkristályosítva 2,27 g fehér kristályos anyagot kapunk, amelynek összetétele 90% (4-alliloxi-fenil)-acetamid és 10% [4— (2,3— -epoxi-propoxi)-fenil]-acetamid a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás meghatározás szerint. [Oszlop: Lichrosorb RP8 (10 Mm), 25 cm x 1/4” (6,35 mm) külső étm., 4,9 mm belső átm., mozgó fázis 40% acetonitril vízben, 2 ml/perc, UV detektálás]. A körülbelül 230 mg l4-(2,3-epoxi-propoxi)-fenil]-acetamidot tartalmazó kristályosított extraktumot 40 ml vízmentes etanolban oldjuk, utána 2,5 ml izopropil-aminnal visszafolyó hütő alatt 5 óra hosszat forraljuk, majd a felesleges oldószert ledesztilláljuk. A maradékot 50 ml diklór-metánban oldjuk, és 3 x 50 ml 0,2 n sósavoldattal extraháljuk. A savas fázisokat egyesítjük, diklór-metánnal mossuk, majd utána 5 n nótrium-hidroxid ol5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
