201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
9 HU 201116 B 10 ciójával), és a kötött keverék transzformálásával egy mikroorganizmusba. Az ilyen plazmidok létrehozását végre lehet hajtani a promoter véletlenszerűen végzett beiktatásával a plazmid különböző helyeire. A korrekt beiktatás azonosítható a szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok válogatásával (screenelésével) a szabályozható promotorból történő megnövekedett átírást biztosító körülmények között. Az ilyen plazmidok egyszerű válogatása a plazmid-hordozó sejtek különböző körülmények közötti növekedési tulajdonságainak elemzéséből áll. A plazmid DNS mennyiségét a gazdasejtben különböző módon lehet mérni, elsősorban agaróz gél elektroforézis segítségével, ismert módon. A kiválogatási módszer könnyen és gyorsan elvégezhető. A találmány egyik speciális megvalósítási módja szerint, amely az A típusú plazmidok megalkotására vonatkozik, a konstrukciós módszer magában foglalja egy természetes szabályozó gén egy részének és proraotorénak kiiktatását, RÍ plazmidból eredő cop B gén esetében Bgl II restrikciós enzimmel hasítva, és ennél a helynél egy DNS fragmens, például egy Bgl II fragmens beiktatásét, beleértve a szabályozható promotort is. A találmány egy másik megvalósítási módja szerint, amely a B típusú plazmidok megalkotására vonatkozik, a konstrukciós módszer magában foglalja a szabályozható promoter beiktatását a plazmidba a természetes replikációs szabályozó rendszerrel ellenkező irányban, az RÍ plazmid-származékok esetében a Bgl II helynél a cop B génnel ellentétes irányban egy részleges hasítás útján Bgl II-vel, majd az összekötést (ligációt) és a transzformációt a szóban forgó mikroorganizmusba, mint pl. E. coliba. Egy más módszer szerint a plazmidot úgy is megalkothatjuk, hogy a részlegesen kiiktatott természetes szabályozó génnel rendelkező A típusú plazmidot használjuk kiindulási anyagként, és a természetes szabályozó gént visszaiktatjuk eredeti helyére, RÍ típusú plazmidok esetében a cop B gént iktatjuk vissza a Bgl II helynél. A találmány egy harmadik megvalósítási módja, amely C típusú plazmidok megalkotáséra vonatkozik, magában foglalja, A tipusú plazmidot használva kiindulási anyagként, egy természetes szabályozó gén beiktatását a plazmidnak egy olyan területébe, ahol ez a vad-típusú szülötórzsben nem helyezkedik el; RÍ tipusú plazmidok esetében a cop B gén beiktatását EcoRl fragmensként az EcoRl helynél a plazmid replikációs területén kívül EcoRl-vel történő hasítás segítségével, majd összekötést és transzformációt. A találmány egy negyedik megvalósitási módja magában foglalja a szabályozható promoter beiktatásán kívül egy második promoter beiktatását is a megfelelő restrikciós helynél, igy lehetővé téve egy strukturgén beiktatását, amelynek kifejeződése a második promotorból szabályozható. Amint fentebb már említettük, ez a hely nem lehet a plazmid replikációs területén belül elhelyezve. A találmány szerinti plazmidok miniplazmidok, azaz észrevehetően kisebbek, mint a vad-tipusú szüló-plazmidok. Általában méretük kb. 2,5-15,0.10® dalton tartományban, gyakran 2,5-10,0.10® dalton tartományban, szokásosan 4,0-12,5.10® dalton tartományban, különösen 4,0-5,0.10® dalton tartományban van. Az ismert . megvaduló* plazmidok szabályozatlan replikációs viselkedése, úgy tűnik, függ a szóban forgó baktériumtörzstől, amelybe azokat transzformálják, és a tápkőzegtól, amelyben a baktérium növekszik, valamint a beiktatott DNS-töl. Ez a függőség valószínűleg annak a ténynek tulajdonítható, hogy az ismert plazmidok .megvaduló* replikációs viselkedését részben egy egyedi nukleotid helyettesítése okozza a cop B promotorban, enyhe növekedést idézve elő az átírási sebességben, amelyet a környezeti változások, figyelemmel az érintett baktérium fajra és törzsre és/vagy a tenyészet tápközegére, valamint a plazmidba beiktatott idegen plazmidok befolyásolnak. A találmány szerinti plazmidok nem tűnnek hasonlóképpen korlátozottnak, mint az erős idegen promotorok, és amikor aktiváltak vagy derepresszáltak, növelik az átírási sebességet olyan mértékig, hogy az ilyen változásoknak nincs jelentőségük. Következésképpen ezeket a plazmidokat a törzsek széles választékába lehet transzformálni és ezek sokkal megbízhatóbban kezelhetők, mint az ismert .megvaduló" plazmidok. A jelen találmány kiterjed azokra a plazmidokra is, amelyek Rl-töl eltérő vad-tipusú plazmidokból származnak, és/vagy más plazmid-befogadó mikroorganizmusban találhatók, mint az E. coli. Lehet olyan fentebb leírt tipusú plazmid megalkotását kitűzni célul, amelyet olyan mikroorganizmusban lehet fenntartani, amely természet szerint nem fogad be plazmidokat. Több különböző mikrobiális plazmid replikációs rendszeréről mutatták ki, hogy több szempontból hasonlók. így pl. az összes ismert plazmid átírást igényel, ha replikációt kell végrehajtani. A találmány alapelvének hasznosításával lehetővé válik a szabályozatlan replikáció fenotípusát másik plazmidokba átvinni, úgy, hogy azok a plazmidok, amelyek klónozó faktorként már használatban vannak és ismertek abból a szempontból, hogy jól működnek a kívánt mikroorganizmusban, .megvaduló* viselkedést szerezhetnek. igy egy szabályozható promoter, pl. aPb beiktatáséval a megfelelő helynél ilyen plazmidba - olyan módon, hogy az átírás ebből a promotorból szabályozza a replikációt - szabályozatlan replikáció megy végbe olyan körülmények között, amelyek a promotorból megnövekedett átírást biztosítanak. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 i
