201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
43 HU 201116 B 44 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás alacsony hőmérsékleten, illetve gátolt körülmények között konstans, kis kópiaszámot mutató, magasabb hőmérsékleten, illetve nem gátolt körülmények között jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot mutató plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy RÍ típusú plazmidokba hőérzékeny represszor gént tartalmazó fág-DNS-t vagy kémiailag szabályozható promoter szekvenciát építünk be megfelelő restrikciós enzimes emésztéssel és ligálással, majd a kapott plazmidot E. coliban transzformáljuk, transzformánsokat izolálunk antibiotikum-rezisztencia és/vagy A-fertőzés és/vagy metabolit-gátlás alapján, és a transzformánsokból a plazmidot kívánt esetben kinyerjük. (Elsőbbsége: 1982.09.24.) 2. Eljárás alacsony hőmérsékleten konstans, kis kópiaszámot mutató, magasabb hőmérsékleten jelentősen megnövekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot mutató plazmidok előállítására, azzal jellemezve, hogy RÍ típusú plazmidokba hőérzékeny represszor gént tartalmazó fág-DNS-t építünk be megfelelő restrikciós enzimes kezeléssel és ligálással, majd a kapott plazmidot E. coliban transzformáljuk, transzformánsokat izolálunk antibiotikum-rezisztencia és/vagy A-fertőzés alapján, és a transzformánsokból a plazmidot kívánt esetben kinyerjük. (Elsőbbsége: 1982.09.16.) 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a) E. coli CSH50 törzsben, DSM2467 számon deponált pOU51 plazmid előállítására pJL20 plazmid DNS-t és EDA4 fág DNS-t BglII-vel hasítunk, a hasítási terméket T4 ligázzal összekötjük, a ligáit keveréket E. coliba transzformáljuk, kanamicin-rezisztencia és A-fertőzés alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből kívánt esetben kinyerjük a plazmidot; b) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2468 számon deponált pOU53 plazmid előállítására az a) lépés szerinti módon kapott plazmidot HindlII-raal részlegesen emésztve a kanamicin-rezisztenciagént kiiktatjuk, a kapott plazmidokat E. coliba transzformáljuk, kanamicin érzékenység és a fertőzés alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük; c) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2469 számon deponált pOU56 plazmid előállításéra a b) lépés szerinti módon kapott plazmidba A : : Tn3 fág DNS-t iktatunk be, a kapott plazmidokat E. coliba transzformáljuk, az ampicillin-rezisztencia és A-immunitás alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük; d) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2470 számon deponált pOU57 plazmid előállítására a c) lépés szerinti módon kapott plazmidból BamHI-EcoRI emésztéssel a transzpozíció-gént kiiktatjuk, a kapott tapadós végeket pBR322--ból származó kis BamHI-EcoRI fragmenssel kapcsoljuk, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia és X-fertőzés alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kivént esetben kinyerjük; e) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2471 számon deponált pOU71 plazmid előállítására a d) lépés szerinti módon kapott plazmid BglII helyére pKN1562 plazmidból származó, copB gént tartalmazó BglII fragmenst iktatunk, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia és A-fertőzés, majd copB gén jelenléte alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük; f) E. coli CS1150 törzsben, DSM 2472 számon deponált pOU73 plazmid előállítására a d) lépés szerinti módon kapott plazmid EcoRI helyére pOU16 plazmidból származó, copB gént tartalmazó EcoRI fragmenst iktatunk, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia, A-fertózés és copB gén jelenléte alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük; g) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2473 számon deponált pOU75 plazmid előállítására az e) lépés szerinti módon kapott plazmidból HindlII enzimmel végzett részleges emésztéssel az EcoRI helyet kiiktatjuk, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia és A-fertőzés alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük; h) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2474 számon deponált pOU106 plazmid előállitására az e) lépés szerinti módon kapott plazmid BamHI-BglI helyére pMC903 plazmidból származó, lac-gént tartalmazó BamHI-BglI fragmenst iktatunk, a kapott plazmidot E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia és 0- -galaktozidáz képzés alapján transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kívánt esetben kinyerjük; i) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2481 számon deponált pOU79 plazmid előállitására az e) lépés szerinti módon kapott plazmidot BamHI enzimmel teljesen és PstI enzimmel részlegesen emésztjük, és pMC871 BamHI és Pstl enzimmel végzett teljes emésztése útján kapott DNS fragmenssel ligáljuk, a ligációs keveréket E. coliba transzformáljuk, ampicillin-rezisztencia alapján laktóz-indikátor lemezeken transzformánsokat izolálunk, és ezekből a plazmidot kivánt esetben kinyerjük; j) E. coli CSH50 törzsben, DSM 2482 számon deponált pŰU82 plazmid előállítására az I) lépés szerinti módon kapott plazmidot BamHI enzimmel teljesen és Sáli enzimmel részlegesen emésztjük, és pSKS104 plazmid BamHl-SalJ fragmensével ligáljuk, a kapott plazmid lac Z génjében található EcoRI-Clal fragmenst pVH1424 plazmid EcoRI-Clal frag-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 24
