201116. lajstromszámú szabadalom • Eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására
1 HU 201116 D 2 A találmány tárgya eljárás megfelelő feltételek között szabályozatlan replikációs viselkedésű plazmidok előállítására. A találmány közelebbről olyan plazmidok előállítására vonatkozik, amelyek alacsony hőmérsékleten, illetve gátolt körülmények között konstans, kis kópiaszámot, magasabb hőmérsékleten, illetve nem gátolt körülmények között jelentősen megnővekedett vagy szabályozatlan kópiaszámot mutatnak. Szabályozott gén-kifejezés céljára szolgáló két plazmidból álló rendszert ismertetnek Sninsky és munkatársai a Gene 16, 275- -286 (1981) irodalmi helyen. A plazmid-rendszer a lac Z promotort és hőmérsékletfüggő replikonokat tartalmaz. Az egyik plazmid egy, a lac represszort kódoló gént tartalmaz, de 42 °C-on nem replikálódik; a másik plazmid, amely magasabb hőmérsékleten .megvaduló* replikációs viselkedést mutat, egy, a lac Z gén operátor-promotor rendszere által szabályozott, szerzett gént tartalmaz. Magasabb hőmérsékleten a lac promoter funkció depressziója és a lac által szabályozott gén kópiaszám-sokszorozódása együttesen következik be. Nackman és munkatársai a Cell 13, 65-78 (1978) helyen in vitro rekombinációs módszert ismertetnek a lac promotornak a lambda-fág Cl represszorától különböző távolságokba történő helyezésére a pMB9 plazmidban azért, hogy E. coliban bármilyen gén magas szinten történő kifejeződését érjék el, a gén eredetétől függetlenül. Feltételesen nem-szabályozott replikációs viselkedésű plazmidok (úgynevezett .megvaduló* plazmidok) ismeretesek pl. a publikált 78101877. 5. számú Európa szabadalmi bejelentésből. Ezeknek a plazmidoknak a replikációja hőmérsékletfüggő, ami azt jelenti, hogy a plazmidok szabályozott, állandó, kis kópiaszámot mutatnak, amikor egy bizonyos hőmérsékleten, pl. 30 °C hőmérsékleten növekednek, és kópiaszámuk szabályozatlanná válik, amikor a gazda-baktérium ettől eltérő hőmérsékleten, pl. 36 °C hőmérsékleten növekszik. A fentebb emlitett szabadalmi bejelentésben foglalt plazmidokat az RÍ plazmid kémiai mutagénnel történő kezelésével izolálták, az RÍ plazmid olyan vad-típusú plazmid, amelyről ismeretes, hogy autonóm módon replikálódik Escherichia coli-ban. A mutagén kezelést két szakaszban hajtották végre, az első szakasz egy olyan plazmidhordozó bakteriális klón izolálásából állt, amelyben a plazmid kópiaszáma 30 °C hőmérsékleten 1-2 volt, és 40 °C hőmérsékleten 4-5-ször több, míg a második szakasz egy olyan bakteriális klón izoláláséból állt, amelyben a plazmid nem-sza-1 bályozott kópiaszámot mutatott a nagyobb hőmérsékleten. A .megvaduló' viselkedést mutató plazmidok tehát a szülóplazmid kettős mutánsai voltak. A fentebb emlitett szabadalmi bejelentés ismerteti az olyan miniplazmidokat is, amelyek klónozó vektorként használhatók, mivel viszonylag könnyen transzformálhatok a gazda-baktériumba kis méretük következtében. Ezek a miniplazmidok megőrzik a hőmérsékletfüggő .megvaduló' replikációs viselkedésért felelős géneket. A fentebb emlitett szabadalmi bejelentésben foglalt plazmidok klónozó és termelő vektorként használhatók, hogy egy idegen DNS beiktatott fragmenseinek gén-termékét lehessen nyerni. A plazmidok hőmérsékletfüggő replikációját hasznosítani lehet pl. eukarióta eredetű DNS-fragmensból eredő gén-termékek megnövekedett mennyiségű termeléséhez. A génterraékek ilyen növelése nem lehetséges a hagyományos plazmid DNS mennyiség-növelő technikákkal, amelyek lehetnek pl. a klóramfenikol hozzáadása a tápközeghez, mivel a klóramfenikol jelenléte a fehérje-szintézis megállítását eredményezi. A fentebb említett szabadalmi bejelentésben foglalt plazmidokat előnyösen lehet alkalmazni mint klónozó és termelő vektorokat olyan esetekben, ahol egy beiktatott idegen gén egy olyan terméket kódol, amely káros arra a baktériumra, amelybe a plazmidot transzformálták; alacsony hőmérsékleten a plazmidok kópiaszáma kicsi, és ennek következtében kevés a gén-kifejeződés. Ez azt jelenti, hogy a tenyészet sokszorozódási szakasza során, amelyet kis hőmérsékleten hajtanak végre, a baktérium nem valószinű, hogy károsodik. A jelen találmány tárgya tehát olyan új plazmidok előállítása, amelyek legalább egy szabályozható promotort hordoznak, amely olyan módon van beiktatva, hogy az ebből eredő átírás szabályozza a plazmid-replikációt. Nevezetesen a találmány olyan plazmidokra vonatkozik, amelyekben a szabályozható promotor jelentősen megnövekedett vagy nem-szabályozott replikációt idéz elő, amikor a plazmidokat tartalmazó gazda-mikroorganizmusokat olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek megnövekedett átírást biztosítanak a promotorból. A találmány tárgya továbbá az a módszer, amellyel ezeket a plazmidokat előállítjuk. A plazmidok klónozó és termelő vektorként használhatók. Az már ismert, hogy egy szabályozható promotort iktatnak be a plazmádba beiktatott és a kívánt gén-terméket kódoló struktúráén kifejeződésének szabályozására. Azt azonban újnak véljük, hogy olyan szabályozható promotort iktatunk be a plazmidokba, amelynek segítségével lehetővé válik a képződött plazmid-kópiák számának szabályozása. A találmány tehát egyrészt egy olyan plazmidra vonatkozik, amelybe egy szabályozható promotor olyan módon van beépítve, hogy az ebből a promotorból eredő átírás szabályozza a replikációt, és különösen olyan módon, hogy a megnövekedett átírás egy lé5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
