201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
9 HU 201115 B 10 ciókat hordozó szakaszokhoz megfelelően illeszteni kell. Először a promotert tartalmazó DNS-szakaszt és a TPA-t kódoló szakaszt a helyes orientációban kell összekapcsolni. Ha két orientáció lehetséges, akkor a helyeket szokásos restrikciós elemzéssel választjuk ki. Helytelenül orientált TPA gént tartalmazó hibrid-vektorokat újra orientálhatunk, ha a beépített gént megfelelő restrikciós endonukleázzal kihasítjuk, és a gént újra összekötjük a hibrid vektor fragmettel. A helytelen orientációt elkerülhetjük, ha két olyan DNS-szakaszt kötünk össze, melyek mindegyike a két végén különböző restrikciós enzimmel van emésztve. A hibrid-vektort továbbá úgy kell elkészíteni, hogy az lehetővé tegye a helyes transzkripció iniciációt és terminációt. Ami az utóbbi pontot illeti, a traszkripció előnyösen az élesztő kromoszómális DNS-éböl vagy az élesztő 2 mikronos plazmidból származó DNS szakaszban végződik. A transzkripció előnyösen egy élesztőgén, például a PH05 vagy TRP1, transzkripciós terminációs jelét tartalmazó DNS szakasznál áll le. Másodszor, megfelelő leolvasási fázist kell létrehozni. A promoterszakasz és TPA-t kódoló szakasz nukleotid sorrendje rendszerint ismert az összekapcsolás előtt, vagy egyszerűen meghatározható [lásd (10)], úgy hogy nem okoz gondot a helyes leolvasási fázis létrehozása. Ha az érett TPA direkt kifejeződésére van szükség, akkor az adott estben a promoterszakaszt kővető és/vagy adott estben az érett TPA-t kódoló szakaszt megelőző szignálszakaszokat el kell távolítani, például egy exonukleázzal, mondjuk Bal31-gyel való emésztéssel. Az élesztő promoter és a TPA-t kódoló szakasz közvetlen összekötésére előnyös szakasz a fő mRNS startjel és az élesztő promoterhez természetben kapcsolódó gén kódoló szakaszának ATG-triplettje között van. Az ebben a régióban való összekapcsolásnál a TPA-t kódoló szakasznak saját ATG-triplettel kell rendelkeznie a transzlációs iniciálásához, vagy ezt egy további szintetikus oligonukleotid hozzáadásával kell létrehozni. Az élesztőpromotert egy szintetikus oligodezoxinukleotid, mint összekötő molekula felhasználásával is hozzákapcsolhatjuk a TPA-t kódoló szakaszhoz. így a promoter régiót, ha lehetséges, leszűkíthetjük, a 3’-végénél úgy, hogy hiányozzon egy előre meghatározott számú bázispár belőle. Analóg módon, a TPA-t kódoló szakaszt is emészthetjük az 5’ vége közelében. Ezután egy olyan szintetikus oligodezoxinukleotidot állíthatunk elő, melyet ha az élesztópromoter és a TPA-t kódoló szakasz összekapcsolására használunk, akkor visszavisszük a hiányzó bázispárokat, beleértve egy ATG transzlációs iniciációs jelet, és a TPA-t kódoló szakasz a promoterhez képest a helyes leolvasási fázisba kerül. A közbenső termékeket, például azokat a vektorokat, melyekből még egy vagy több lényeges funkció hiányzik, valamint a találmány szerinti végső hibrid-vektorokat adott esetben egy baktérium gazdába, főleg Escherichia coli-ba transzformáljuk a fenti okok miatt (például a közbenső termékek és hibrid-plazmidok előállítása nagy mennyiségben). Ezért a bakteriális replikációs origót és genetikai marker(eke)t tartalmazó bakteriális vektorok, úgymint az Escherichia coli pBR322 plazmid, vagy ennek a fenti alkotókat tartalmazó fragmentjei a legelőnyösebb tulajdonságú vektorok. Ilyen bakteriális vektor használata esetén az élesztő hibrid-vektorok előállításának végső lépései közé tartozik előnyösen az élesztő genetikai marker és replikációs origó beépítése. 2. Az élesztő transzformálása TPA-t kódoló szakaszt tartalmazó hibrid-vektorokkal A jelen találmány tárgya továbbá eljárás szöveti plazminogén aktivátor termelésére képes transzformált élesztósejtek előállítására, azzal jellemeve, hogy az 1. pontban leírt hibrid-vektorok bármelyikével transzformálunk élesztősejteket, vagy a szöveti plazminogén aktivátor génjét integráljuk egy élesztőkromoszómába. A használható élesztők közé tartoznak a Saccharomyces, Schiosaccharomyces, Torulopsis és rokon nemzetségekbe tartozó élesztőfajok [lásd (11)] főleg a Saccharomyces cerevisiae törzsei. Az élesztő hibrid-vektorokkal való transzformálását a szakterületen ismert eljárásokkal hajthatjuk végre, például a Hinnen és munkatársai által leirt [lásd (12)] módszer, szerint. Ez a módszer három lépésre bontható. 1) Az élesztő sejtfal eltávolítása. 2) A .csupasz' élesztósejtek (szferoplasztok) kezelése a transzformáló DNS-sel PEG (polietilénglikol) és Ca2t ionok jelenlétében. 3) A sejtfal regenerálása és a transzformáit sejtek szelekciója szilárd agarrétegben. Előnyös módszerek: ad 1) Az élesztő sejtfalát enzimatikusan távolítjuk el különböző glükozidáz készítmények, például csiga bélnedv (például GlusulaseR vagy HelicaseR) vagy mikroorganizmusokból nyert enzim-keverékek (például ZymolyaseR) felhasználásával, ozmotikusán stabilizált oldatokban (például 1 M szorbitol). ad 2) Az élesztő szferoplasztok PEG jelenlétében aggregálódnak és a citoplazma-membránok lokális fúziója indukálódik. A .fúzió-szerű' állapot nagyon fontos, és számos transzformált élesztósejt diploid vagy éppen tripolid lesz a transzformációs eljárás során. A fuzionált szferoplasztok szelekcióját lehetővé tevő eljárásokat használhatunk a transzformánsok dúsítására, azaz könnyebben 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
