201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
5 HU 201115 B 6 biztosítsuk a TPA hatékony kifejeződését. A jelen találmány egy előnyös kiviteli alakjában az élesztópromotert közvetlenül kapcsoljuk az érett TPA kódoló szakaszához, a kapcsolódásnál egy transzlációs startjelet beépítve. 5 Az élesztő promoter és a TPA kódoló szakasza összekapcsolására alkalmas előnyös szakasz a fő mRNS start és az említett promoterhez természetesen kapcsolódó ATG triplett között van. 10 A jelen találmánynak egy másik előnyös kiviteli formájában szignálszakasz is található a konstrukcióban. Azok a megfelelő szignálszakaszok, melyek természetesen kapcsolódnak a használt promoterhez, főleg a PH05 15 szignálszakasz vagy TPA szignálszakasz. Más szignálszakaszok, például az élesztő invertáz vagy alfa-faktor géneké is használható. Egy változat szerint fuzionált szignálszakaszokat állíthatunk elő, a használt promoterhez tér- 20 mészetesen kapcsolódó gén szignálszakaszának egy részét a TPA szignálszakaszának egy részével összekötve. Azok az előnyös kombinációk, melyek lehetővé teszik a szignálszakasz és az érett TPA aminosav-kódoló 25 szakasz közötti pontos hasítást. További szakaszokat, például pro- vagy spacerszakaszokat, melyek vagy hordoznak, vagy nem, speciális feldolgozási jeleket, is tartalmazhat a konstrukció, hogy megkönnyítsék a prekur- 30 zor molekulák pontos megváltoztatását. Más megoldás szerint olyan fúziós fehérjék állíthatók elő, melyek a helyes in vivo vagy in vitro érést lehetővé tevő belső feldolgozó jelet tartalmaznak. A feldolgozó jelek előnyösen 35 Lys-Arg csoportot tartalmaznak, melyet felismer egy, a Golgi-membránban található élesztő-endopeptidáz. A TPA kifejeződése során a géntermék bejut a kiválasztási útba és periplazmatikus 40 térbe kerül. Ha a sejtfalon keresztül további kiválasztást tudunk elérni a tenyészlébe, ezáltal nagymértékben fokozható a termelőképesség. A kinyerési eljárás is egyszerűsíthető, ha nem kell a sejteket feltárni. A TPA-t 45 ezenkívül az N-terminális véghez hozzáadott metionin nélkül nyerhetjük ki, mivel az érett kódoló szakasz előtt nincs szükség egy ATG triplettre, mint transzlációs startjelre. A glikozilezett TPA-nak számos tulajdonsága van, 50 mely a glikozilezetlen TPA-val szemben előnyössé teszi. A glikozilezett TPA jobban hasonlít az emlős sejtekből kinyert eredeti TPA-ra mint a glikozilezetlen. A TPA szerű fehérjék harmadlagos szerkezete valószínűleg 55 bizonyos fokig függ a glikozilmaradékok jelenlététől. Várható, hogy a TPA molekulához kapcsolósó szénhidrát molekulának előnyös hatásuk van a kémiai stabilitásra és a farmakológiái hatásra. 60 Az élesztőpromoter és a TPA-t kódoló szakasz mellett a találmány szerinti vektorok további, a promoter működése, azaz a TPA-t kódoló szakasz kifejeződése szempontjából lényegtelen, vagy kevésbé fontos további 65 DNS szakasz(oka)t tartalmaznak, de ezeknek fontos funkciójuk lehet, például az említett hibrid vektorokkal transzformált élesztősejtek szaporításában. A további DNS szakaszok) származhatnak a prokarióta és/vagy eukarióta sejtekből, és kromoszómába és/vagy extrakromoszómális DNS szakaszokat tartalmazhatnak. A további DNS szakaszok származhatnak (vagy tartalmazhatnak) plazmid DNS-ból, úgymint bakteriális vagy eukarióta, plazmid DNS-ból, virális DNS-böl és/vagy kromoszómális DNS-böl, úgymint baktérium, élesztő vagy raagasabbrendű eukarióta kromoszómális DNS-ból. Az előnyös tulajdonságú hibrid vektorok baktérium-plazmidokból, főleg az Escherichia coli pBR322 vagy rokon plazmidokból, a lambda fágból, az élesztő 2 mikronos plazmidjából és/vagy élesztő kromoszómális DNS-ból származó további DNS szakaszokat tartalmaznak. A kiegészítő DNS szakaszok előnyösen élesztő replikációs origót és egy élesztőben működő, szelektív markert tartalmaznak. Az élesztő replikációs origót, például egy kromoszómális, autonóm replikálódó szakaszt (ars) tartalmazó hibrid-vektorok transzformálás után autonóm módon extrakromoszómálisan fennmaradnak az élesztósejtben és autonóm módon replikálódnak a mitózis során. Az élesztő 2 mikronos plazmid-DNS-ével homológ szakaszokat tartalmazó hibrid vektorok is használhatók. Ezek a hibrid-vektorok rekombinációval integrálódnak a sejtben már jelenlévő 2 mikronos plazmidokba vagy autonóm replikálódnak. A 2 mikronos szakaszok különösen alkalmasak nagy frekvenciával transzformáló plazmidokhoz, és nagy kópiaszámot eredményeznek. A találmány szerinti hibrid-vektorok ezenkívül a gazdaélesztő kromoszómáján levő gén egy részét tartalmazó DNS szakaszt tartalmaznak (például a PH05 gént vagy promoterét, a TPA-t kódoló szakaszhoz kötve). A homológ szakasz révén, mely 20-100 dezoxinukleotid hosszúságú lehet, az egész vektor, vagy annak lineáris fragmentje stabilan beépülhet a gazdakromoszómába rekombináció útján. így a szaporítás sorén az utódsejtek megtartják, szelekciós nyomás nélkül is, a bevitt genetikai anyagot. Például ha a TPA gén két végére egy élesztő kromoszómális génben természetesen előforduló szakaszokat kötünk, például egy élesztő kromoszómális gén promoter szakaszát az 5’ végre és az említett gén 3’ végének egy részét a 3’ végre, akkor a TPA-t kódoló gén stabilan beépülhet az említett kromoszómális gén helyére. A jelen találmány egy előnyös kiviteli formájában a PH05 promotert, a TPA-t kódoló szakaszt és a PH05 3' végét tartalmazó lineáris DNS szakaszt használjuk arra, hogy a TPA gént beépítsük a megfelelő élesztőkromoszómába, azaz a II élesztőkromoszómába, a PHOS gén helyére. 5
