201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
41 HU 201115 B 42 15 °C-os inkubálás után. A ligáló elegyből 4 pl-es alikvot részeket adunk 100 pl kalciummal kezelt, transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejtekhez (lásd 4a. példa). Négy transzformált amp" telepet külön-külön felnövesztünk 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t Holmes és munkatársai módszerével (26) izoláljuk, és KpnI valamint Smal/BamllI emésztéssel elemezzük. Egy olyan, p31RL-lel jelölt kiónt választunk a további munkához, mely KpnI restrikciós endonukleázzal hasítható, és a Smal/BamHI kettős emésztés után a várt restrikciós fragmenteket kapjuk. A p31R plazmidot helyettesíthetjük a p31Y vagy bármely következő, a 6c példában említett plazmiddal: p31P, p31V, p31L, p31N, p31C, p31H, p31S, p31k és p311. Az EcoRI-gyel hasított, defoszforilezett p31Y DNS-t a foszforilezett, EcoRI-gyel hasított linker DNS-sel kapcsoljuk össze. A transzformációt és az arap* telepek analízisét a fent leirt módon végezzük. A várt restrikciós mintázatot mutató kiónok közül egyet kiválasztunk és p31RL jelöléssel látjuk el. B. A TPA DNS beépítése a p31RL plazmidba (16. ábra) a) A p31RL plazmid emésztése Ncol-gyel 5 pg p31RL DNS-t a szállító (Biolabs) által előírt körülmények között Ncol restrikciós endonukleázzal emésztünk. Az oldatot a teljes emésztődés lejátszódása után feriol-kloroformos extrakcióval fehérje-mentesijük, és a DNS-t etanolos kicsapással koncentráljuk. A DNS-t 10 mM TRIS-HC1 (pH8) puffer ban oldjuk, 0,25 mg/ml koncentrációban. b) A Klneow DNS polimeráz reakciója az Ncol-gyel hasított p31RL DNS-sel 5 ug, Ncol-gyel hasított p31RL DNS-t 100 pl, 60 mM, TRIS-HC1 (pH7,5), 10 mM magnézium-klorid, 4 pM dATP 30 uCi[ot-Mp]-dATP, 0,1 mM dTTP, 0,1 mM dCTP és 0,1 mM d GTP összetételű pufferban 8 egység Klenow DNS polimerázzal (nagy fragment, BRL) inkubálunk. 15 perces szobahőmérsékleten való inkubálás után a jelöletlen dATP koncentrációját 0,1 mM-ra növeljük. Az inkubálást újabb 45 percig folytatjuk szobahőmérsékleten. A reakciót fenol-kloroformos extrakcióval állítjuk le. A DNS-t etanolos kicsapással tőményítjük és 0,25 mg/ml koncentrációban 10 mM TRIS-ilCl (pH8) pufferban oldjuk. Az a) és b) reakciók egy alternatívájaként a p31RL DNS-t KpnI restrikciós endonukleézzal, majd T4 DNS polimerázzal kezeljük, a c) és d) reakciók szerint: c) A p31 RL plazmid emésztése Kpnl-gyel 10 pg p31RL DNS-t emésztünk meg a szállító (Bikolabs) előírásai szerint. Az elegyet fenol-kloroformmal extraháljuk. A DNS-t etanollal kicsapjuk, majd 0,4 mg/ml koncentrációban 10 mM Tris-HCl (pI18) 0,1 mM EDTA összetételű pufferban oldjuk. d) A T4 DNS- polimeráz reakciója Kpnl-gyel hasított p31RL DNS-sel 9 pg KpnI enzimmel hasított p31RL DNS-t 2,5 percig 37 °C-on inkubálunk 10 egység T4 DNS polimerázzal (42) 100 pl 33 mM TRIS-acetát (pH7,9) 66 mM kálium-acetát, 10 mM magnézium-acetát és 0,5 mM DTT összetételű oldatban (trimmelési lépés). A trimmelt DNS-nél reszintézisét megnövelt 200 pl térfogatban végezzük 33 mM TRIS-acetát (8pH7,9) 66 mM kálium-acetát, 10 mm magnézium-acetát, 0,5 mM DTT, 0,4 uM dATP, 30 pCi[cC-32p]-dATP, 0,1 mM dTTP és 0,1 mM dCTP és 0,1 mM dGTP jelenlétében. 18 órán át 37 °C-on inkubáljuk az elegyet, majd a jelöletlen dATP koncentrációját 0,1 mM-ra növeljük és az inkubálást további 35 percig folytatjuk 37 °C-on. A reakciót fenol-kloroformos extrakcióval állítjuk le. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 0,4 mg/ml koncentrációban oldjuk 10 mM TRIS-IIC1 (pH8) pufferban. e) A lineáris, DNS-polimerázzal kezelt p31RL plazmid DNS emésztése Smal-gyel 4,5 pg Ncol-gyel és Klenow DNS polimerázzal kezelt p31RL I)NS-t (9 Bp példa) vagy 4 pg KpnI-gyel és T4 DNS-polimerázzal inkubált p31RL DNS-t Smal restrikciós endonukleázzal teljesen megemésztünk. A DNS-t etanollal kicsapjuk és 100 pl 50 mM TRIS-HCL (pH 8,0) pufferban oldjuk. f) A 4,3 kb méretű nagy DNS fragment izolálása és defoszforilezése A nagy 4,3 kb méretű DNS fragmentet Tris-borát-EDTA pufferban (pH8,3) 0,8%-os preparatív agaróz gélből izoláljuk, a DNS-t tartalmazó agaróz-darabot kivágva a gélből. Mindegyik gél-blokkban levő DNS-t külön-külön elektro-eluáljuk 1,5 ml ötszörösre hígított TRIS-borát-EDTA (pH8,3) puffénál töltött dialízis hüvelyben. A lezárt hüvelyeket TRIS-borát-EDTA (pH8,3) pufferba merítjük. 30 percig 100 mA áramot engedünk át rajta, majd 45 másodpercre megváltoztatjuk az áram poliaritását, hogy a DNS-t eltávolitsuk a dialízis-membrán faláról. A dialízis-hüvelyben levő góldarabot körülvevő puffert kivesszük a nátrium-klorid koncentrációját 150 mM-ra állítjuk és DE 52 (Whatman) ioncserélő oszlopon bocsátjuk keresztül. A DNS-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 23
