201115. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fibrinolitikus anyagok előállítására élesztővel
37 HU 201115 B 38 rid, 12 mM magnézium-klorid, 12 mM kalcium-klorid és 1 mM EDTA összetételű pufferban. 3-3 pg-os alikvot részeket kiveszünk 90, 120, 150 másodperces, 30 °C-os inkubólás utón és azonnal összekeverjük 50 /ul fenollal és 60 pl TNE-vel, Fenol-kloroformos extrakció és etanolos kicsapós utón a DNS-t 100 pg/ml koncentrócióban 10 mM Tris-HCl (pH8,0) pufferban oldjuk. A Bal31 exonukleózos emésztés mértékének meghatározása céljából minden egyes időpontból 0,7 pg DNS-t tartalmazó alikvot részeket kiveszünk, HindlII-mal emésztünk és agaróz gólelektroforózissel analizálunk. A további analízis céljára a 90 másodpercig emésztett DNS-t használjuk. 2,2 pg plazmid DNS-t 1 órán ót, 37 °C-on 2,8 egység Klenow DNS polimerózzal inkubálunk (a polimeráz I nagy fragmentje, BRL) 35 pl 60 mM Tris-HCl (pH7,5), 10 mM magnézium-klorid és mindegyik dNTP-ből 0,1 mM összetételű pufferban. 3 pg Xhol linkért (5’-CCTCGAGG-3’, Collaborative Research) 35 egység T4 polinukleotid kinéz enzimmel (Boehringer) kezelünk 30 percig 37 °C-on, 50 pl, 60 mM Tris-HC1 (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid, 4 mM DTT és 0,5 mM ATP összetételű pufferban. 0,67 pg kinázzal kezelt Xhol linkért és 0,4 pg Bal31-gyel kezelt p31R tompavégű plazmid DNS-t ligólunk éjszakén át szobahőmérsékleten 450 egység T4 DNS ligózzal 25 pl, 60 mM Tris (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP összetételű pufferban. A ligáit DNS-t a feleslegben lévő linkertől izopropanolos kicsapóssal választjuk el 10 m, EDTA, 0,3 M nátrium-acetát (pH6,0) jelenlétében, 0,54 térfogat izopropanollal. Miután 35 percig szobahőmérsékleten tartottuk a keveréket, a DNS-t centrifugálással ülepítjük. Az üledéket levegőn szárítjuk és 17 pl, 6 mM Tris (pH7,9) 150 mM nátrium-klorid, 6 mM magnézium-klorid és 6 mM merkapto-etanol összetételű pufferban oldjuk. A DNS-hez kapcsolt Xhol linkereket Xhol enzimmel hasitjuk, a DNS-t iozopropanollal kicsapjuk a fentiek szerint és ligálással körbezórjuk. 6 órán át 15 °C-on ligáljuk a DNS-t 50 pl, 60 mM Tris-HCl (pH7,5) 10 mM magnézium-klorid, 10 mM DTT, 1 mM ATP összetételű pufferban 600 egység T4 DNS ligózzal, majd 10 pl-t adunk a ligáló elegyekből 100 pl kalciummal kezelt, transzformációra kompetens E. coli HB 101 sejtekhez (lásd 4a. példa). 24 amp* rezisztens telepet növesztünk külön-külőn 100 mg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A plazmid DNS-t lp31R (Xhol)] izoláljuk, és HaelII emésztéssel analizáljuk. Két plazmidot választunk és a terminátor fragmenten az Xhol hely melletti szakasz nukleotid-sorrendjót Maxam és Gilber módszerével (10) meghatározzuk. A nukleotid-sorrend a 15. ábrán látható. d) A PHO-TPA hibrid gén átvitele á pJDB207 élesztövektorokba (lásd 13. ábra) Az M13 mp9/PH05-TPA RF plazmidot a fentiekben leírt módon készítjük el. Ebből a DNS-ből 2 pg-ot BamHI (Biolabs) és Sáli (Biolabs) restrikciós endonukleázzal emésztünk, és a 2,6 kb fragmentet alacsony olvadáspontű agaróz gélből izoláljuk (lásd 5c. példa). Hasonlóan állítjuk elő 100 ng-ot a P1I05 terminátort tartalmazó p3lR (Xhol) plazmid 134 bp méretű HindlII-XhoI fragmentjéből. Ezenkívül 1 pg pJDB207 plazmidot (22) emésztünk Bamlll-gyel és Hindlll-mal, majd a 6,5 kb fragmentet alacsony olvadáspontű agaróz gélen való elektroforózis utón izoláljuk. Mindhárom fragmenből 0,5 pg-ot 200 egység T4 DNS-ligózzal (Biolabs) összeligázunk éjszakán át 15 °C-on, 20 pl 60 mM Tris-HCl (pH7,5), 10 mm magnézium-klorid, 10 mM DTT, 1 mM ATP, összetételű pufferban. Az E. coli HB 101 törzs transzformálását a 4a példában leirt módon végezzük ampicillin, rezisztens telepeket szelektálva. Négy telepet izolálunk, plazmid DNS-t állítunk elő belőlük (a 2. pédában leirt módszerrel), és a DNS-t BamHI, HindlII és BstEII restrikciós enzimekkel emésztve analizáljuk. Az egyik plazmidot pJDB207/P//O5-TPA/lA) jelzéssel látjuk el. e) A pJDIIkO7/PI105-77 Via plazmid készítése (lásd 14. ábra) Az M13 mg 9/PH05-TPA kettős szálú DNS-ből 10 pg-ot Sall-gyel emésztünk. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t 0,5 mg/ml koncentrációban oldjuk 10 mM TRIS-HC1 (pH8,0) pufferben. A Bal31- -es emésztéseket lényegében a 8c. példában leirt módon hajtjuk végre, majd Xhol linkereket adunk hozzá. E. coli JM101 törzsbe való transzformálás után RF DNS-t izolálunk, és az Xhol linker helyét a didezoxi szekvenáló módszerrel határozzuk meg, az 5'-GAACGGTAGGTATTGATTG-3’ oligodezoxinukleotid primer felhasználásával. Az Xhol linkereket különböző helyen tartalmazó M13 származékokat következőképpen nevezzük: M13mp9/Pl 105-TPA (Xhol-l) M13mp9/P//05-TPA (XhoI-2) M13mp9/P//05-TPA (XhoI-3) M13mp9/P//05-TPA (XhoI-4) Az Xhol linkerek 1-4 helyzetét mutatják az alábbiakban: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 21
