201114. lajstromszámú szabadalom • Eljárás treponema hyodysenteriae bakterin előállítására
1 HU 201114 B 2 A találmány tárgya eljárás Treponema hyodysenteriae szaporítására megfelelő táptalajon, majd az így kapott sejtek bakterinben történő alkalmazására, aminek során a táptalajban szarvasmarhából származó, koleszterinben gazdag frakciót alkalmazunk. A sertések vérhasmegbetegedése (sertés-dizentéria) súlyos, nyálkahártya vérzéssel járó hasmenés, amely elsősorban elválasztás után sújtja a malacokat. E betegség megszüntetését általában kemoterápiás szerek és antibiotikumok alkalmazásával érték el; mindeddig azonban nem találtak hatásos, nem-vegyszeres (nem-gyógyszeres) kezelést a betegség megelőzésére. A Treponema hyodysenteriae anaerob spirochéta a sertés-dizentéria elsődleges kórokozója. A 4 100 272 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti olyan vakcina vagy bakterin alkalmazását, amely elolt T. hyodysenteriae sejteket tartalmaz, s amelynek segítségével a sertéseknek dizentériával szembeni ellenállóképessége növelhető. Ez a megoldás nem terjedt el széles körben, mert az így kapott bakterin-termék aktivitása viszonylag alacsony. Az ismertetett kezelési eljárás hat intravénás befecskendezésből áll. Kívánatos tehát olyan bakterin előállítása, amely kevesebb intramuszkuláris befecskendezést igényel kezelési eljárásként. Ismert, hogy koleszterinben gazdag frakciók felhasználhatók egyes mikroorganizmusok szaporodásának az előmozdítására. A J. Bacteriol. 135, 818 (1978) helyen leírják koleszterinben gazdag frakciók alkalmazását Mycoplasma pneumoniae és Mycoplasma arthritidis szaporodásának az elősegítésére. A J. Gen. Microbiology 116, 539 (1980) helyen leírják az Egyesült Államok Gyógyszerkönyve szerinti koleszterin alkalmazását T. hyodysenteriae szaporítására. Mindeddig nem javasolták koleszterinben gazdag, szarvasmarhából származó frakciók konkrét alkalmazását T. hyodysenteriae sejtek hozamának a növelésére azzal a céllal, hogy ezeket a sejteket sertés-dizentéria leküzdésére alkalmas bakterinbe foglalják. A találmány szerinti eljárást bármilyen virulens T. hyodysenteriae törzzsel megvalósíthatjuk. Virulens az a törzs, amely típusos sertés-dizentéria-fertózés előidézésére képes. E célra két különleges törzset (a B204 és B234 törzset) találtunk alkalmasnak; e törzseket az .American Type Culture Collection' gyűjteményben helyeztük el, ahol az ATCC No. 31212 (B204) és az ATCC No. 31287 (B234) sorszámot kapták. A T. hyodysenteriae törzs olyan táptalajokon szaporítható, amelyek magzati borjúszérummal vagy magzati bérányszérummal, glükóz, L-cisztein-hidrokloriddal, B12 vitaminnal és élesztőkivonattal kiegészített triptikus szójaleveskeveréket (Difco Laboratories) tartalmaznak. A találmány szerinti tökéletesítés abban áll, hogy ezekben a táptalajokban a T. hyodysenteriae sejtek szaporítása céljából koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót alkalmazunk. A koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakció előnyösen 1,0- -2,5 térf.% mennyiségben van jelen a táptalaj térfogatára vonatkoztatva, azonban 0,1- -5,0 térf.% mennyiségben is alkalmazható. A találmány szerinti eljárás végrehajtására alkalmas, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciók számos forrásból beszerezhetők. A Code 82-010 jelzésű koleszterin-koncentrátum beszerezhető a Miles Scientific Division of Miles Laboratories-tól, és szarvasmarha-szérumból állítható elő a 4 290 774 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban közölt és igényelt eljárással. Alkalmas termék továbbá a Biocell Laboratories cégtől beszerezhető List 3200 jelű, szarvasmarhából származó koleszterin-koncentrátum. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható, előnyös, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót az alábbi lépésekből álló eljárással állítjuk elő: (a) folyékony, koleszterint tartalmazó szarvasmarha-plazmát vagy -szérumot vagy azok frakcióját kovasavas adszorbenssel hozzuk érintkezésbe, és a koleszterint adszorbeáljuk; (b) az adszorbeált koleszterint a folyékony plazma vagy szérum többi részétől elkülönítjük; (c) az adszorbeált koleszterint kifagyasztjuk és felengedni hagyjuk; (d) az adszorbeált koleszterint 9,0-11,5 pH-érték mellett eluáljuk; (e) az eluált koleszterinoldatot ultraszűréssel töményítjük; (f) a tömény koleszterinoldat pH-értékét 11.0- 11,4-re állítjuk; (g) a tömény koleszterinoldatot nátrium-karbonáttal, majd vízzel szemben dializáljuk; (h) a diaiizéit koleszterinoldatot ultraszűréssel 0,5-30 mg/ml koncentrációig tovább töményítjük; (i) a tömény koleszterinoldat pH-értékét 7.0- 11,0-ra állítjuk; (j) a tömény koleszterinoldatot 30 perctől 24 óráig terjedő időtartammal 50-100 °C hőmérsékleten melegítjük; és (k) a tisztított, koleszterinben gazdag szarvasmarha-frakciót elkülönítjük. Ezt a specifikus frakciót és előállítási eljárást leírjuk és igényeljük az e bejelentéssel egyidóben ugyanazon bejelentő által benyújtott, 732 856 alapszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben. A koleszterinben gazdag frakció előállítására kiinduló anyagként bármilyen szarvasmarha-vérplazma vagy -szérum vagy annak frakciója alkalmazható, amely koleszterint tartalmaz. Előnyösen alkalmazható kiinduló anyag a szarvasmarha-szérum. Ha a kiinduló anyag szérum, akkor előnyös egy oldható só, például nátrium-citrát hozzáadása 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
