201098. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyűrűs peptidek, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
7 HU 201098 B 8 további desztilláció nélkül felhasználható. A trifluor-ecetsav (TFA), diizopropil-etilarain (DIPEA) és a diciklohexil-karbodiimid (DCC) a Chemical Cyanamid Corporation cégtől vásárolt .szekvenciális’ tisztaságú termék. Az etán-ditiolt (EDT) a Sigma Chemical Co. cégtől vásároltuk és további tisztítás nélkül használtuk fel. Találmányunk során L-konfigurációjú és a Bachem cégtől vásárolt védett aminosavakat alkalmazunk feltéve, hogy mást nem közlünk. A szilárdfázisú szintézis módszereknél a különböző aminosav-egységek reakcióképes oldallánc-csoportjait olyan tipikus védőcsoportokkal védjük meg, amelyek megakadályozzák a kémiai reakció lejátszódását az adott helyen, majd a védőcsoportot a kívánt reakció lejátszódása után eltávolítjuk. Bár a szilárdfázisú szintézis kapcsán bizonyos védőcsoportokat kiemeltünk, megjegyezzük, hogy az egyes aminosavak az oldatfázisú szintéziseknél használt bármely szokásos megfelelő aminosav-védöcsoporltal megvédhetők. A fenti védőcsoportok közül a karboxilcsoport megvédésére szokásos védöcsoportok példáiként az észtereket, pl. aril-észtereket, különösen fenil-észtereket vagy kis szénatomszámú alkil-, halogén-, nitro-, tio- vagy kis szénatomszámú (1-7 szénatomos) alkil-tio-helyettesítőt hordozó fenilésztereket említjük meg. Az összes alfa-amino-csoportot tercier butoxikarbonil-csoporttal (BOC) védjük meg. Az oldallánc csoportokat a következőképpen védjük: Asp, Glu, Thr benzilcsoporttal; Trp formilcsoporttal és Tyr 2,6-diklór-benzilcsoporttal; Lys 2-klór-Z vagy Z-csoporttal. A fenti vegyületek tisztaságát vékonyréteg-kromatográfiéval (TLC) és az optikai forgatóképesség mérésével igazoljuk. Benzil-hidril-amin (BHA) gyantaként a Beckman Instruments cégtől beszerzett, szemcse alakban (200-400 mesh) levő, 1% divinil-benzolt tartalmazó sztirol) divinil-benzol kopolimert alkalmazunk. Az összes nitrogéntartalom 0,654 railliekvivalens/g. Az alábbi berendezéseket alkalmazzuk. A vékonyréteg-kromatografálást (TLC) üvegre felvitt, előre bevont szilikagél 60 F254 lemezeken (Merck) megfelelő oldószer-rendszerek felhasználáséval végezzük el. A foltokat UV fluoreszencia segítségével (254 nm abszorpció), jódos megfestéssel vagy ninhidrines permetezéssel (primer és szekunder aminok esetében) mutatjuk ki. Az aminosav-analízis céljából a peptideket fenolt tartalmazó 6 n sósavban 115 °C-on 24 órán át vákuum alá helyezett Reacti-Therra hidrolízis csövekben hidrolizáljuk (Wheaton Scientific Company, Milville N.J. 08332). Az analízist Beckman 121 M aminosav analizátorral hajtjuk végre. A nagy teljesítőképességű folyadékkromatografálást (HPLC) Laboratory Data Control (LDC) márkájú készülékben végezzük el, amely Constametric I szivattyúból, Constametric III szivattyúból, Gradient Master oldószer programozóból és keverőbői, valamint Spectromonitor III változtatható hullámhosszú UV detektorból áll. Az analitikai HPLC-t Waters Micro Bondapack Cis fordított fázisú oszlopok (0,4 x 25 cm) segítségével végezzük el. A preperativ HPLC szétválasztásokat Whatman (2,5 x 50 cm) Partisii M20 10/50 ODS-3 oszlopon vagy (2,3 x 30 cm) mikro Bondapack Cis oszlopon futtatjuk; mindkét esetben Whatman Co; Pell ODS pelliculéris töltetet tartalmazó elő-oszlopot alkalmazunk. A peptideket lépésenként szilárd hordozón, Vega 250 peptid szintetizátor felhasználásával kapcsoljuk össze. A kémiai modult Model 300 mikroprocesszorral (Vega Biochemicals) a 16. és 20. lépés műveleteinél pedig kézi működtetéssel szabályozzuk. 5 g Boc-N-metil-Phe-t (17 millimól) benzhidrilamin gyantához (5 g) kapcsolunk, 1,8 g DCC (9 millimól) felhasználásával, 0 °C-on. A felvételt aminosav-analizissel határozzuk meg; a mért érték 0,20 millimól/g gyanta. A reagálatlan aminocsoportokat 6-6 ekvivalens ecetsavanhidriddel és piridinnel történő kezeléssel blokkoljuk. Egy, a gyantával kezdődő tipikus szintézis-ciklus menetét az alábbiakban ismertetjük. Lépés Reagens Idő 1 1% EDT/CH2CI2 1x30 mp 2 50% TFA/CH2CI2 1% EDT lxl perc 3 1. lépést megismételni 4 50% TFA/CH2CI2 1% EDT 1x15 perc 5 CH2CI2 1x30 mp 6 2-propanol 1x30 mp 7-8 5. és 6. lépést megismételni 9 CH2CI2 2x30 mp 10 8% DIPEA 2x2 perc 11-15 5-9. lépést megismételni 16 5 ekv. Boc-Aminosavanhidrid 1x30 perc 17 1% DIPEA 1x5 perc 18-19 6-9. lépést megismételni 20-21 Ha Kaiser-teszt pozitív, 16-17. lépést megismételni 22 2-propanol 1x30 mp 23-24 5-6. lépést megismételni 25 CH2CI2 1x30 mp 26 DMF 2x30 mp 27 CH2C12 3x30 mp Az összes mosási és kapcsolási műveletnél az oldószer térfogata 10-20 ml/g gyanta. A kapcsolásokat a Boc-aminosavak szimmetrikus anhidridjeivel végezzük el. A reakciókat CH2Cl2-ben 0 °C-on 15 percen ét, 10 ekviva-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
