201098. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyűrűs peptidek, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
19 HU 201098 B 20 5. példa Kétszeri etetésből álló táplálási kísérlet 180-200 g testtömegű him Sprague-Dawley (CD) patkányokat (Charles River Breeding Laboratories) 22 °C hőmérsékletű kamrában 12 órás világos/sötét ciklusokkal (reggel 6 órától délután 6 óráig) akklimatizáltatunk. Az állatokat két napon át éheztetjük, majd lemérjük, egyenként külön ketrecekbe helyezzük és a négynapos etetési tréninget megkezdjük. Ez alatt az idő alatt a patkányok etetőedényekben őrölt laboratóriumi tápot (Purina Lab Chow) kapnak reggel 9,00 és reggel 10,00 között; az etetóedényeket reggel 10,00 és 12,00 között eltávolítjuk, majd 12,00 és délután 1,00 óra között a ketrecekbe visszahelyezzük. E .1-2-1* etetési időszak sorén a patkányok a két óra alatt naponta hozzávetőlegesen annyi tápot fogyasztanak mint azok a patkányok, amelyek a napi teljes 24 óra alatt ad libitum fogyaszthatnak élelmet. Az állatokat a 4. napon újra lemérjük és a több mint 5 g testtömeg-veszteséget mutató patkányokat kizárjuk a kísérletből. Az állatokat ezután kísérleti (n=5-6) és kontroll (n=6-12) csoportokba osztjuk, testtömegüktől függetlenül. A találmányunk szerinti eljárással előállított peptideket nátrium-klorid-oldatban (oldható peptidek esetében) vagy 1%-os gumi-arabicumban (oldhatatlan vegyületek esetében) szuszpendáljuk, 32-320 ug/ml/kg testtömeg koncentrációban, majd az etetési időszak 5. napján az első etetés előtt 15 perccel intraperitoneálisan beadagoljuk. A patkányokat ugyanúgy etetjük, mint az első négy napon és a tápot tartalmazó etetőedényeket minden egyes etetés előtt és után a táplálékfelvétel meghatározása céljából lemérjük. A táplélékfelvételt az átlagérték átlagos és standard hibájaként a különböző csoportok kontroli-értékeinek százalékában fejezzük ki. A kezelt csoportok értékeit a kontroll csoportnál mért adatokkal a .t’-teszt analízissel hasonlítjuk össze. Az eredményeket az I. táblázat tartalmazza. 6. példa 400 mikroliter gyomornedvet és 200 mg Ac-Tyr( SÜ3H )-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-N-rae- I------------------------_l til-Phe-NH2 képletű, az 1. példa szerinti peptidet és CCK-8-t [H-Asp-Tyr(SOaH)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2] 37 °C-on különböző időtartamokon át inkubálunk. A lebomlást analitikai HPLC módszerrel mikro Bondapack Cm oszlopon (0,4x x30 cm) 10-40% lineáris gradiens szerint 0,01 mólos NH4AC/CH3CN elegyekkel 40 percen át követjük nyomon, 2 ml/perc átfolyási sebesség mellett; a kimutatás 225 nm-nél történik. Az eredményeket az 1. példa szerinti peptid esetében a szulfatálatlan Ac-Tyr-Lys-Gly-Trp-Met-Asp-N-metil-Phe-NH2 feltétele_______________I zett termelésére, míg a CCK-8 esetében a CCK-8-nak megfelelő csúcs eltűnésére alapozzuk. Peptid Inkubációs idő (perc) %-os lebomlás (terület) 1. példa 0 0 60 1.4 180 3.6 1380 12.8 CCK-8 0 0 15 90 60 100 5 10 15 20 25 30 35 40 45 12
