201093. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szomatotropin szolubilizálására és kinyerésére
19 HU 201093 B 20 8. példa A 7. példában körvonalazott eljárást követve MPS-t szolubilizálunk 4 °C hőmérsékleten vizes, 7,5 mól/literes karbamid oldatban, amely 90 mmól/liter triszt is tartalmaz (pH 11), három különböző koncentrációnál (20,40 és 80 mg üledék) nedves süly(/ml fenti karbamid oldat). Az oldatok mintáit 90 mmól/literes trisz és/vagy karbamid oldattal higitjuk olyan módon, hogy 3 mól/liter karbamid koncentrációt és 1 mg/ml MPS koncentrációt nyerjünk. A hígított MPS oldatokat levegő hatásának tesszük ki kevert körülmények között 4 °C hőmérsékleten 56 órán át. A HPLC-vel végzett mérések az átlagos MPS monomer kitermelést 69 súly%-nak mutatják. 9. példa A 6. példa szerinti eljárást követjük azzal a kivétellel, hogy a szolubilizálást és helyreállítást 0,1 mmól/liter 1,4-ditiotreitol jelenlétében hajtjuk végre. A HPLC-vel végzett mérések az átlagos MPS monomer kitermelést 66 súly%-nak mutatják. 10. példa A BGH három változatát, nevezetesen az Ala-i-et, Ala-i Valizs-ot és Met-i Vali26-ot kifejezzük E. coli-ban a 704, 362 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (benyújtva 1985 február 22-én, bejelentő: Krivi, G.G., címe: Production of Proteins in Procaryotes (Fehérjék előállítása prokariótákban)) általában megadott eljárást követve; a fenti bejelentést ebbe a bejelentésbe hivatkozásként építjük be. A BGH változatokat szolubilizáljuk és helyreállítjuk, az 1. példában leírt általános eljárást követve. A megfelelő BGH változatokat tartalmazó fénytörő testecskéket az 1. példában leirt módon nyerjük ki. Mintegy 300 g (nedves súly) fénytörő testecskét szuszpendálunk vízben, hogy 1 liter zagyot nyerjünk. Ezt a zagyot mintegy 5 liter 9 mól/literes karbamid-oldathoz adjuk, amely 108 mmól/liter triszt is tartalmaz, igy olyan szolubilizáló oldathoz jutunk, amely a megfelelő BGH változatot 7,5 mól/liter karbamidot és 90 mmól/liter triszt tartalmazó oldatban tartalmazza 10.5 pH-nál, 4 °C hőmérsékleten. A teljes szolubilizálás néhány perces keverés alatt bekövetkezik. 4 liter hideg vizet adunk lassan a keverékhez, hogy kialakítsuk a helyreállító oldatot, amely a megfelelő BGH változatot 4,5 mól/liter karbamidot és 54 mmól/liter triszt tartalmazó oldatban tartalmazza 10.5 pH7nál és 4 °C hőmérsékleten. Az oldatot kevertetjük és a megfelelő BGH változatot oxidálódni hagyjuk, az old ttot levegő hatásának kitéve mintegy 48 órán át. Az oxidált BGH-változat oldatot HPLC-vel mérjük, mindhárom BGH változatnál mintegy 60-70 súlyX monomer-kitermelést mutatva ki. 12 11. példa A fentebb leírtak szerint nyert szomatotropin fehérje szerkezeti homológiáját meghatározzuk a természetes hipofízis szomatotropin szerkezetéhez cirkuláris dikroizmussal, amint ezt Bewley leírta: Recent Progress in Hormone Research, 35. kötet, 155-210 oldal (Academic Press). Pontosabban az MBS-t és a BGH Ala-i változatát hasonlítjuk össze a bovin hipofízis szomatotropinnal. A mintákat feloldjuk 50 mmól/literes nátrium-bikarbónát oldatban (pH 9,5), és a fentebb leírt technikával elemezzük. Ennek az elemzésnek az eredményei igazolják, hogy az itt leírt módon készített rekombináns szomatotropin a helyreállítás után természetes konformációban van. 12. példa Az 1. példában leírt módon készített, MBS-t tartalmazó fénytörő' testecskéket öszszekeverünk nem pufferolt, vizes 1,0 mól/literes karbamid-oldattal 4 °C hőmérsékleten. A pH-t nátrium-hidroxiddal állítjuk be és tartjuk fenn 12,1 értéken. Az oldat feltisztulása jelzi a teljes szolubilizálódást. A fénytöró testecske koncentrációt mintegy 10 mg/ml-nek határozzuk meg spektrofotometriás elemzéssel, amint ezt az 1. példában leírtuk. 13. példa Az 1. példában leírt módon készített, MBS-t tartalmazó fénytörő testecskéket feloldunk 3,0 mól/literes dimetil-szulfon-oldatban, 28 °C hőmérsékleten, pH=ll,8-nál és 2 mg/ml MBS koncentrációnál. A feloldott MBS oxidációja levegőn olyan oxidált MBS-t eredményez, amely lényegében nem különbözik attól, amelyet 4,5 mól/liter karbamidot, pH=ll,3-at (50 mmól/liter trisz) alkalmazva nyerünk 5 °C hőmérsékleten, amint ezt az intermolekuláris kötések mértéke alapján megítéljük. 14. példa Az 1. példában leirt módon készített, MBS-tartalmú fénytörő testecskéket feloldunk 3,0 mól/literes, vizes karbamid-oldatban, 4 °C hőmérsékleten, és 11,25 pH-értéken, melyet 10%-os nátrium-hidroxid-oldattal állítunk be. Az oldódás után 100 1 fenti oldathoz 2,2 l 0,0153 t%-os hidrogén-peroxid-oldatot adunk, és 30 órán át 4 °C hőmérsékleten tartjuk. Az MBS monomer kitermelése 80X. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
