201085. lajstromszámú szabadalom • Eljárás foszfortartalmú vegyületek és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
13 HU 201085 B 14 amelyet több mérés összesített eredményéből, 95%-os megbízhatósági határok között számítunk ki. Ha a vizsgálandó anyag lakton formában van, akkor azt úgy alakítjuk ót nótriumsóvó, hogy dimetil-szulfoxidban feloldjuk, és 10- -szeres moláris feleslegben nátrium-hidroxidot adunk hozzá, majd 15 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Az elegyet ezután részlegesen, 7,5-8,0 pH-ra semlegesítjük 1 N sósavval, és megfelelő hígításban adjuk az elegyhez, amelyben az enzimreakciót végezzük. 2) Koleszterin szintézise frissen izolált patkánymój sejtekben Azokat a vegyületeket, amelyek a HMG-CoA reduktáz működését gátolták, megvizsgáltuk, hogy vajon ugyancsak képesek-e gátolni a (14C) ecetsav beépülését a koleszterinbe, patkányok frissen izolált májsejtjeiben. A vizsgálati módszert eredetileg Capuzzi és munkatársai közölték [Capuzzi, D. M. és Margolis, S. Lipids, 6: 602 (1971)]. a) Patkányok májsejtjeinek izolálása 180-220 g-os, Sprague uawiey patkányok Nembutol 50 mg/kg-os dózisával altatunk. Felnyitjuk a hasat, és a portális véna első elágazását kötéssel elzárjuk. Ezután 100-200 egység heparint fecskendezünk közvetlenül a hasi cavalis vénába. A portális véna egy távolabbi szakaszán egyetlen záróöltést helyezünk el, majd az öltés és az első elágazás között kanűlt vezetünk az érbe. A májon ezt követően 20 ml/perc sebességgel 37 °C-ra előmelegített és oxigénnel dúsított .A" pufferoldatot (HBSS = Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldat, amely kalciumot és magnéziumot nem, viszont 0,05 mól etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmaz) áramoltatunk át, miután előzőleg a cavalis vénát elmetszettük, hogy az effluens elvezetése biztosítva legyen. A máj perfúzióját később 200 ml előmelegitett „B” pufferoldattal [HBSS = Hanks-féle sóoldat, amely 0,05% bakteriumtos) eredetű kollagenázt tartalmaz] folytatjuk, majd a májat kioperáljuk, kifejtjük a burkából, és 60 ml Waymouth-féle tápoldatban diszpergáljuk a sejteket. Ezután szobahőmérsékleten, kis sebességgel, 50 g-vel 3 percig centrifugálva az elegyet, elkülönítjük a májsejteket, amelyeket még egyszer mosunk Waymouth-féle tápoldattal. A sejtek életképességét tripánkékkel végzett festéssel állapítjuk meg. A fenti módon készített dúsított sejtszuszpenzióban az életképes sejtek aránya általában 70 és 90% között van. b! ^C)Ecetsav beépülése a koleszterinbe A májsejteket ismételten felszuszpendáljuk inkubációs oldatban (0,02 mól Tris-hidroklorid, pH = 7,4; 0,1 mól kálium-klorid; 3,3 mmól nátrium-citrát; 6,7 mmól nikotinamid; 0,23 mmól NADP; 1,7 mmól glükóz-6-foszfát), olyan töménységben, hogy a sejtek száma 2 mililiterenként 5xl06 legyen. A vizsgálandó anyagot feloldjuk dimetil-szulfoxidban vagy dimetil-szulfoxid és víz 1:3 arányú elegyében. A dimetil-szulfoxid végső koncentrációja az inkubációs oldatban nem haladja meg az 1,0%-ot, és ezért gyakorlatilag nem befolyásolja a koleszterin szintézisét. Az inkubálást a megfelelő (14C) acetát (58 mCi/mmól, 2 pCi/ml) hozzáadásával indítjuk el, majd a sejtszüszpenziót, amelynek térfogata 2 ml, egy 35 mm-es szövettenyésztö edényben 2 óra hosszat 37 °C hőmérsékleten tartjuk. Az inkubálás végeztével a szuszpenziót áttöltjük egy üvegből készült centrifugacsőbe, és 3 percen át 50 g-vel, szobahőmérsékleten centrifugáljuk. Az összetömörödött sejtfrakciót 1 ml vízben felszuszpendáljuk, miáltal egyúttal el is roncsoljuk, majd jégfürdőbe helyezzük. A zsírok kiextrahálását lényegében E.G. Bligh és W.J. Dyer módszerével [Can. J. Biochem. and Physiol., 37: 911 (1959)] végezzük. A felső szerves fázist elválasztjuk és nitrogénáramban szárazra pároljuk, majd a maradékot 100 pl 2:1 arányú kloroform-metanol-elegyben felszuszpendáljuk. A teljes mintát felcseppentjük szilikagél vékonyréteg-kromatográfiás lemezre, majd a kromatogramot hexán, dietil-éter és ecetsav 75:25:1 arányú elegyében kifejlesztjük. A lemezt egy BioScan automata sugárzósmérö készülékkel letapogatjuk, és a 0,28 Rf-értéknél található koleszterin radioaktivitását meghatározva, annak értékét az extraktum összes radioaktivitásának százalékában fejezzük ki. A rutinszerűen elvégzett vizsgálatok során a koleszterincsúcs radioaktivitása 800-1000 cpm-nek adódott, ami a lipid-extraktum őszszes radioaktivitásának 9-20%-a. Az eredmény jó egyezést mutat a Capuzzi és munkatársai által megadott értékekkel; ók az extrahálható radioaktivitás 9%-át találták a koleszterinben. A vegyületek hatását, vagyis a koleszterin szintézisét gátló hatást úgy állapítjuk meg, hogy meghatározzuk a koleszterinbe beépült nyomjelző nukleid százalékos menynyiségét a vizsgálandó minta jelenlétében, illetve anélkül. Két vagy több kísérlet mérési eredményeiből megszerkesztjük a dózis-hatás diagramot, amelyből megállapíthatjuk 95%-os megbízhatósági határokkal az Iso értékét. 3) Koleszterinszintézis az emberi bőr kötőszöveti sejtjeiben A vegyületek kiválasztása során, a májszövetben kifejtett gátló hatás mértéke alapján állapíthatjuk meg az adott vizsgálati mintáról, hogy rendelkezik-e koleszterin szintézisét gátló hatással. Mindazonáltal a máj sejtjeiben gátló hatásúnak bizonyult ko5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
