201078. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szubsztituált tieno-imidazol-származékok és a vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
25 HU 201078 B 26 2-[5-(4-Fluor-benzil-oxi)-4-morfolino-pirimidin-2-il-metil-szulfinil]-lH-tieno[3,4-d]imidazol, op.: 125 °C (bomlik). 39. példa 40. példa 2-[4-Piperidino-5-(2,2,2-trifluor-etoxi)-pirimidin-2-il-metil-szulfinil]-lH-tieno[3,4- -djimidazol, op.: 168 °C (bomlik). 4L példa 2-(4-(N,N-Dimetil-amino)-5-(2,2,2-trifluor-etoxi)-pirimidin-2-il-metil-szulfinil]-lH-tieno[3,4-d)imidazol, op.: 155 °C (bomlik). 42. példa 2-[4-Morfolino-5-(2,2,2-trifluor-etoxi)-pirimidin-2-il-metil-szulfinil]-lH-tieno[3,4-d)imidazol, op.: 165 °C (bomlik). 43. példa 2-f4-Pirrolidino-5-(2,2,2-trifluor-etoxi)-pirimidin-2-il-metil-szulfinil]-lH-tieno[3,4- -dlimidazol, op.: 155 °C (bomlik). 44. példa 2-(4-Piperidino-5-(4,4,4,3,3,2,2-heptafluor-butoxi)-pirimidin-2-il-metil-szulfinil]-lH-tieno[3,4-d]imidazol, op.: 172 °C (bomlik). Farmakológiai vizsgálatok - In vitro kísérlet: H’, K* ATP-ázt tartalmazó gyomorüregekkel végzett kísérlet: A H*, K* ATP-ázt tartalmazó membránüregeket sertésgyomorból állítottuk elő (1.). Az ATP-áz hatást 37 °C-on mértük, az ATP-ből felszabaduló szerves foszfátként. Közelebbről 10 mikromól koncentrációban, úgy hogy az ICw érték meghatározásához 0,01-100 mikromól koncentrációban előinkubáltuk a vegyületeket pH 6,0 értékű enzimtartalmú pufferekben. A 37 °C-on 30 percig végzett előinkubálás után a pH 6,0 értékű közeget Hepes/Tris pufferrel 7,4 pH-ra állítottuk be. Az enzimes reakciót Tris-ATP hozzáadásával indítottuk be. Az össz-reakció térfogata 1 ml volt és az elegy 20 Mg üreges proteint 4 mmól magnéziumkloridot, 10 mmól káliumkloridot, 20 Mg nigericint, 2 mmól Tris-ATP-t, 10 mmól Hepest és még 2 mmól Pipest tartalmazott, pH 6,0 értékű élőinkubálási közegben. 4 perc múlva a reakciót 10 pl 50%-os triklór-ecetsav hozzáadásával leállítottuk.. A denaturált fehérjét centrifugáltuk és a Pl tartalmat a (2) irodalmi helyen leirt módon határoztuk meg. Az ATP hidrolízise nem haladta túl a 15%-ot. A gátlást a maximális stimuláláshoz képesti gátlás X-ában számítottuk ki és az IC50-et probit-analizissel számítottuk. 14C-amino-piridin-felhalmozódás izolált nyúl-gyomormirigyekben: 2-3 kg-os nyulakat nyaki töréssel vagy ficammal anesztézia segítségével öltük le. A nyulak gyomrát nagy nyomáson a (3) irodalmi helyen leírt módon ömlesztettük át. A corpus-részben lévő gyomornyálkahártyát lekapartuk és ollóval felaprítottuk. A nyálkahártya-darabokat 1 mg/ml kollageneázt tartalmazó közegben inkubáltuk 30-45 percig 37 °C-on. A közeg mikromólban 100 nátrium-kloridot, 5 kálium-kloridot, 0,5 nátrium-dihidro-foszfátot, 1 dinátrium-hidro-foszfátot, 1 kalcium-kloridot, 1,5 magnéziura-kloridot, 20 nátrium-hidrokarbonátot, 20 Hepes-t, 2 mg/ml glukózt és 1 mg/ml nyúl-albumint tartalmazott és a pH-t 1 mól Tris segítségével 7,4-re állítottuk. A mirigyeket nylon-meshen keresztül leszűrtük, így eltávolitottuk a durva fragmenseket és háromszor átöblítettük az inkubáló közegben. A mirigyeket 2-4 mg száraz súly/ml végső koncentrációra hígítottuk. A gyomormirigyek savképzóképességét AP-akkurauláció alapján mértük (4. irodalmi hely). 1,0 ml mirigy-szuszpenzió-mintákat 1 ml közegben egyensúlyoztunk, amely 0,1 pCi/ml 14C-AP-t tartalmazott 37 °C-on egy rázás alatt lévő vízfürdőn a tesztelt anyaggal együtt. 20 perc múlva hozzáadtunk 1 mmól dbcAMP-t, majd 45 percig inkubáltuk. A mirigyeket ezután a közegtől rövid centrifugálással elkülönítettük, a felülúszó aliquotjait és a digerált mirigy-pelletet folyékony scintillóciós számlálóval határoztuk meg. Az AP felhalmozódását az AP mirigyen belüli vízben és az inkubálási közegben lévő arányként számítottuk ki (5. irodalmi hely). Az egyes meghatározásokat háromszor ismételtük meg, az ICso-et probitanalizissel számítottuk ki, ahol a 0X az alap és 100X maximálisan stimulált AP-aránynak felel meg. In vivo kísérletek: Pylorus-elkötött patkányokon: Ezt a kísérletet nőnemű Wistar patkányokon végezzük, melyeknek testsúlya 150- -170 g volt (6). A táplálékot 16 óra hosszat megvontuk a kísérlet előtt, de vizet ad libitum adtunk az állatnak. A pylorus-elkötés után, melyet éter-anesztézia alatt végeztünk, a teszt-gyógyszert intraperitonálisan adagoltuk. Az anyagokat IX Tylose-ben szuszpendáltuk és 2 ml/kg térfogatban 5 mg/kg dózisban adagoltuk. A gyomorsav-elválasztást szubkután Desglugastrin 400 ug/kg adagolásával stimuláltuk. A későbbi injekciót 1 óra múlva megismételtük, a kísérlet kezdete után 3 órával az állatokat leöltük, a gyomrot kivágtuk és a felhalmozódott sav koncentráció-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 15
