201026. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biciklusos vegyületek és az ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 201026 B radék vizeletet körülbelül 30 perces egyensúlyba jutási idő alatt távolítottul: el a húgyhólyagból. Ezután a spontán ürített vizeletet 50 ml űrtartalmú, előre lemért csövekbe gyűjtöttük. Két, egyenként 1 órás kontroll időszak után az állatoknak orális úton, zselatin kapszulában beadtuk a vizsgálandó (ül) általános képletű vegyületet vagy az összehasonlító anyagként használt diuretikumot. Egyes vegyieteket 10 ml-es dózisban, orális úton, szondán keresztül adtunk be az állatoknak. A vizsgálat időszaka alatt az állatoknak nem adtunk vizet. A spontán ürített vizeletet további 6 órán keresztül gyűjtöttük (a vizeletgyűjtés teljes időtartama tehát 8 óra volt), majd az állatokat visszahelyeztük ketreceikbe, és az állatoknak enni és inni adtunk. A vizsgálatokat kéthetenként egyszer ismételtük meg, Így két vizsgálat között az állatok szervezete regenerálódhatott. Az összegyűjtött vizeletminták tömegét és térfogatát mértük, és a vizeletgyűjtést követő napon meghatároztuk a vizeletben lévő elektrolitok (nátrium, kálium, klorid) mennyiségét. A vizeletben lévő elektrolitok mennyisége hasonló volt az ismert diuretikumokkal végzett kezeléssel elérthez, azzal az eltéréssel, hogy nem észleltünk túlzott kálium-ürítést. (B) kísérlet: A kísérleteket Marshall Animal Facility vagy White Eagle Laboratories törzstenyészetből származó tacskó kutyákon végeztük. A vizsgálatokhoz 9-13 kg testtömegű, mindkét nemű kutyákat használtunk. A kutyákat standardizált körülmények között tartottuk, és egy konzervdoboz „Prescription Diet P/D kutyaeleséggel kiegészített, ellenőrzött speciális kutyaeledellel etettük. Az állatok tetszés szerint fogyaszthattak vizet. Az elektrolitok alapértékeinek meghatározása előtt az állatokat legalább két hétig tartottuk a megadott diétán. A hatóanyagok beadását megelőzően az állatok véréből 6 alkalommal vettünk mintát az elektrolitkoncentrációk alapértékeinek meghatározása céljából A vérmintákban meghatároztuk a plazma káliumkoncentrádóját, és vizsgáltuk, hogy ez az érték időben mennyire állandó. A plazma káliumkoncentrációját akkor tekintettük időben állandónak, ha a változás mértéke 0,25 mekv-nál kisebb volt. A vizsgálatok céljaira azokat a kutyákat tartottuk fenn, amelyek vérplazmájának káliumszintje az alapérték meghatározásának időszakában 4,00-4,30 mekvvolt. A vérmintákat az állatok első lábából a vena saphena-n vagy a juguláris vénán keresztül vettük le. A vérvételhez 20-as méretű tűt és 5 ml űrtartalmú fecskendőt használtunk, és minden alkalommal 5 ml vért vettünk az állatoktól. A vérmintákat konzerválás céljából 100 jjJ 1000 NE heparint tartalmazó heparin oldattal kevertük össze. A vérmintákat 10 percig 2500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, majd a plazmát pipettával kémcsövekbe mértük be (a kémcsöveket megfelelően megjelöltük), és a mintákat az elektrolit-tartalom meghatározásáig lefagyasztottuk. A kontroll vérminták elemzése után a kutyákat véletlenszerűen csoportokba osztottuk; egy-egy csoport legalább 4 állatból állt. A hatóanyagokat 2/00 vagy 3/00 méretű zselatin kapszulába töltve 5 vagy szondán keresztül orális úton adtuk be az állatoknak. A hatóanyagokat ultrahang-kezeléssel 10 ml fiziológiás sóoldatban szuszpendáltuk. Az állatok testtömegét mértük (az állatok testtömegét a kontrollvizsgálatok 3 napja alatt mért értékek átlagából számítottuk ki), éa a hatóanyagot az állatok testtömegéhez viszonyított mennyiségben (mg/kg) adtuk be. Minden egyes vizsgálatában a vizsgálati időszak azonos napjain, a délelőtti órákban (10 és 11 óra között adtuk be a hatóanyagot az állatoknak. A hatóanyagot kapszulában adtuk be, az állatok szájába fecskendőn keresztül 5-10 ml vizet is juttattunk. Az állatok véréből a vizsgálati időszak 4., 11., 7., 14„ 21. és 28. napján vettünk mintát. A vérmintákat Micro-hematocrit kapilláris csövekbe gyűjtöttük, és a plazmaminták összegyűjtése után azonnal leolvastuk a hematokrit értékeket. Ezután meghatároztuk a plazmaminták káliumkoncentrációját. Az alapértékekhez viszonyítva lényeges eltérést egyetlen esetben sem észleltünk. A felsorolt vizsgálatok alapján a (ül) általános képletű vegyületek eukalémiás diuretikumoknak bizonyultak. A vizsgálatokban a terápiás dózis sokszorosának beadása után sem észleltünk toxicitásra utaló tüneteket. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. Amennyiben a példákban mást nem közlünk^ (i) a műveleteket szobahőmérsékleten (18-15 °C) végeztük; (ii) Az oldószerek lepárlásához forgó bepárlókészüléket használtunk, a lepárlást legföljebb 60 °C fürdőhőmérséklet fenntartásával csökkentett nyomáson (600-4000 Pa, 4,5-30 Hgmm) végeztük; (iii) a gyorskromatografáláshoz Merck Kieselgel Art. 9385 minőségű szilikagélt, az oszlopkromatográfiás műveletekhez Merck Kieselgel 60 Art. 7734 minőségű szilikagélt használtunk (gyártja az E. Merck cég, Darmstadt, Német Szövetségi Köztársaság), a vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálatokhoz 0,25 mm vastagságú GHLF Art. 21521 minőségű, Analtech gyártmányú szilikagél lemezeket használtunk (gyártja az Analtech cég, Newark, Delaware, Amerikai Egyesült Államok); (iv) a reakciók lezajlását rendszerint vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokkal követtük, ezért a közölt reakcióidők csak tájékoztató jellegűek; (v) a közölt olvadáspont-adatok korrigálatlan értékek, esetenként a kémiailag azonos anyagok olvadáspontja polimorfia miatt eltérő; (vi) valamennyi végtermék vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálat és mikroelemzési adatok alapján lényegében tiszta volt; (vii) a közölt hozam-adatok csak tájékoztató jellegűek, mert nem törekedtünk maximális hozam elérésére; (viii) a csökkentett nyomásértékeket Pa egységekben, az egyéb nyomásértékeket bar egységekben adtuk meg; (ix) a közölt oldószer-arányok térfogatarányok; (x) a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokhoz felhasznált „A oldószerelegy metanol trietil-amin és metilén-klorid 25:5:70 térfogatarányú elegye; (xi) a szerves fázisokat nátrium-szulfát fölött szá-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
