201005. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új N-szubsztituált merkapto-propánamid-származékok és ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 201005 B (2) Enkefalináz-inhibitor aktivitás in vivo (a DAME fájdalomcsillapító hatásának potencirozása) Nyomásmérésre alkalmas berendezéssel 20-26 g tömegű, hím Std:ddy egerek farkán kifejtett nyomással fájdalmat váltunk ki. A nyomás hatására bekövetkező fájdalom küszöbértékét (harapási válasz) mm-ben mérjük. 30 perccel a D-Ala-Met - enkefalin (DAME) intraciszternális beadása után 30 perccel orálisan beadjuk a kísérleti vegyületet 0,5%-os vizes tragantgyanta-oldatban feloldva vagy szuszpendálva. A DAME beadása után 5 perccel a fájdalomérzeti küszöböt megmérjük, és így meghatározzuk a kísérleti vegyületeknek a DAME fájdalomcsillapító hatására kifejtett potencirozó aktivitását. A kapott eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg. Miként a 2. táblázat adataiból látható, a DAME fájdalomcsillapító hatását a kísérleti vegyületek dózisfüggő módon potencírozzák. így tehát a kísérleti vegyületek enkefalináz-inhibitor aktivitást mutatnak in vivo. 9 2. Táblázat Kísérleti vegyület ismertető példa száma: ED50 (mg/kg, p.o.) 2. 20,2 7. 38,3 64. 20,8 68.(a)-/2/. 51,0 87. 26,5 (3) Enkefalináz-inhibitor aktivitás in vitro (i) Az enzim elkülönítése Enkefalint lebontó enzimeket különítünk el Gorenstein és Snyder által a Life Science, 25, 2065 (1979) szakirodalmi helyen ismertetett módszerrel. Hím Std:Wistar patkányokat dekapitálunk, majd eltávolítjuk a striatumot. Ezeket azután 30 térfogatrész 50 mmólos Tris-HCl pufferben (pH = 7,4) homogenizáljuk, majd 15 percen át 1000 g-vel centrifugáljuk. A felülúszót ezt követően további 15 percen át 50000 g-vel centrifugáljuk. A kapott szemcséket az említett pufferrel háromszor mossuk, majd ezután 15 térfogatrész 50 mmólos, 1% Triton X-100 márkanevű anyagot tartalmazó Tris- HCl pufferben (pH = 7,4) szuszpendáljuk. Ezt követően 45 percen át 37 °C-on inkubálást végzünk. Ezután 1 órán át 100.000 g-vel centrifugálunk, majd a felülúszót felvisszük DEAE-cellulózt tartalmazó ioncserélős kromatográfiás oszlopra. Az enkefalindipeptidil-karboxi-peptidázt tartalmazó frakciót használjuk enkefalináz-mintaként. (ii) Az inhibitor aktivitás mérése Miután a kísérleti vegyületet és az enkefalinázt 5 percen át 37 °C-on előinkubálásnak vetettük alá, a reakcióelegyhez (3H)-leucin-enkefalint = szubsztrát) adunk és ezt követően 1 órán át 37 °C-on inkubálást végzünk (végtérfogat = 100 pl, a szubsztrát végső koncentrációja: 20 nmól). Ezt követően a reakcióelegyhez a reakció megszakítása céljából jéghideg 0,2 n sósavoldatot adunk. A szubsztrátumot és a metabolitokat elválasztjuk vékonyrétegkromatográfiásan és Porapak Q márkanevű oszlopot használva a Vogel és Alstein által a FEBS Letters, 80, 332 (1977) szakirodalmi helyen ismertetett módszer szerint. Az enzim aktivitást a (3 * * * * * * * (ii)H)-Tyr-Gly-Gly képződési sebességéből állapítjuk meg. A kísérleti vegyületek ICso-értékét az inhibitálási sebességből számítjuk ki, amelyet a kísérleti vegyület jelenlétében és távollétébcn észlelhető enzim aktivitás közötti különbségből állapítunk meg. A kapott eredményeket a 3. táblázatban foglaljuk össze. Miként a táblázat eredményeiből látható, a kísérleti vegyületek enkefalináz-inhibitor aktivitást mutatnak in vitro. 10 3. Táblázat Kísérleti vegyület ismertető példa száma: ED50 (nM) 2. 5,4 7. 7,5 65. 4,6 68.(a)-/2/ 2,1 186. 8,4 187. 7,8 Miként a fenti (l)-(3) kísérletekből nyilvánvaló, a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek kiváló fájdalomcsillapító hatásúak enkefalináz-inhibitor aktivitásukra tekintettel és így felhasználhatók olyan gyógyászati készítmények hatóanyagaként, amelyek különböző, enyhétől közepesig terjedő fájdalmak kezelésére alkalmasak. Ilyen fájdalmakra említhetjük a műtét utáni fájdalmakat, a baleset utáni fájdalmakat, a fogfájást, valamint ízületi megbetegedésekkel és izomcsontrendszerrcl kapcsolatos rendellenességekkel együttjáró krónikus fájdalmakat. Ugyanakkor a találmány szerinti eljárással előállított vegyületeknek alacsony a toxicitása, éspedig a terápiásán hatásos mennyiségnél jóval nagyobb mennyiségekben beadva őket sem tapasztalható a kísérleti állatoknál elhullás. A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek dózisa igen sok tényezőtől, így például a vegyületek típusától, a kezelendő személyek korától és tömegétől, a betegség súlyosságától és a beadás módjától függ, de rendszerint naponta 20 mg és 2 g közötti tartományban van. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítmények beadhatók orálisan vagy parenterálisan. A találmány szerinti eljárással előállított gyógyászati készítmények lehetnek például tabletták, kapszulák, szemcsés készítmények, finomszemcsés készítmények, porok, szirupok, oldatok, szuszpenziók, injekciók vagy kúpok formájában. Ezeket a készítményeket szokásos módon úgy állítjuk elő, hogy a találmány szerinti vegyületeket összekeverjük a gyógyszergyártásban szokásosan használt hordozóés/vagy egyéb segédanyagokkal. A gyógyszergyártásban használt hordozó- és hígítóanyagok bármely hagyományos hordozó- vagy hígítóanyagok lehetnek, a lényeg az, hogy a találmány szerinti vegyületekkel szemben közömbösek legyenek. Az ilyen 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
