200997. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2-/2-hidroxi-3-fenoxi-propil-amino/-etil-fenoxi-metil-amino-származékok és az ezeket a származékokat hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
HU 200997 B Gyógyászatiig elfogadható sókat úgy állíthatjuk elő az (I) általános képletű yegyületekből, hogy a szokásos módon reagáltatjuk őket a megfelelő savakkal. Abban az esetben, ha hidrogén-halogenideket kívánunk előállítani, úgy is eljárhatunk, hogy a szabad bázisokat sztöchionjetrikus mennyiségű benzil-halogenidekkel együtt hidrogénezzük. (Természetesen a megfelelő benzil-halogenidet kell kiválasztanunk.) A találmányunk szerinti eljárások ismertetésével kapcsolatosan a következő biológiai vizsgálati módszereket, adatokat és példákat kívánjuk ismertetni. Az (I) általános képletű vegyületek termogén hatását úgy lehet kimutatni, hogy a következő szabványosított vizsgálati módszerek közül egyet vagy többet alkalmazunk: a) Patkányokat hozzászoktatunk a hideghez olyan módon, hogy hideg környezetben (4 °C-on) tartjuk őket 10 napon keresztül annak érdekében, hogy megnöveljük a termogenetikus kapacitásukat. Ezután a patkányokat áttesszük termoneutrális környezetben (29 °C). Három órával később mérjük a bélhőmérsékfetüket az alapvonal helyzetének megállapítása céljából. Ezt követően szájon keresztül vagy bőr alá beadjuk az állatnak a vizsgált hatóanyagot 0,45 vegyes% nátrium-kloridot és 0,25 vegyest Polysorbate 80-at tartalmazó vizes oldatban feloldva vagy felszuszpendálva. Egy óra elteltével ismét megmérjük a bélhőmérsékletet. Ebben a vizsgálatban szignifikánsan aktívnak tekintjük azt a vegyületet, amely statisztikailag szignifikáns módon mintegy 0,3 °C-kal (vagy többel) emeli a bélhőmérsékletet abban az esetben, ha legfeljebb 15 mg/kg dózisban alkalmazzuk bőr alá fecskendezve. Ez a vizsgálat modellként szolgál a csökkent termogenézishez, amely diétázás közben lép fel. b) Patkányokat hideg környezetben (4 °C) tartottunk négy napon keresztül, hogy megnövekedjék a termogenetikus kapacitásuk. Ezután a patkányokat áttettük két napra meleg (23 °C-os) környezetbe. A következő nap beadagoltunk egy vizsgálat tárgyát képező vegyületet bőr alá vagy szájon keresztül, az a) pontban leírt módon. Egy órával később megöltük az állatokat és a lapockák közül eltávolítottuk a barna színű zsírszövetpárnát (BAT). BAT-mitochondriumot készítettünk differenciális centrifugálással és meghatároztuk a GDP- kötést (Holloway és munkatársai: International Journal of Obesity, 1984, &. 295) mint a termogenetikus aktivitás mértékét. Minden egyes esetben kontrollvizsgálatot is végeztünk, amelynek során az oldatnak vagy a szuszpenziónak csak a hordozóanyagát alkalmaztuk. Végeztünk továbbá egy pozitív ellenőrzővizsgálatot, amelynek során 1 mg/kg menynyiségben alkalmaztunk szulfátja alakjában izoprenalint. A vegyületeket rutinszerűen alkalmaztuk 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 és 10 mg/kg dózisban, majd az eredményeket az izoprenalin által előidézett, a GDP-kötésre gyakorolt hatásra vonatkoztattuk. Ezekből az eredményekből lineáris regresszióanalízissel megállapítottuk, hogy az izoprenalin hatásának 50%-a (ED50) milyen dózissal érhető el. Abban az esetben tekintettük ennek a vizsgálatnak a során aktívaknak a vizsgálat tárgyát képező vegyületeket, 1 i 9 ha a kontrollokhoz viszonyítva jelentős mértékben növelték a GDP-kötést. Ez a vizsgálat annak a kimutatására szolgál, hogy az a) vizsgálat során megfigyelt termogén hatások inkább mutatnak összefüggést a BAT-ra gyakorolt hatás növekedésével, mint valamilyen nemspecifikus vagy toxikus mechanizmussal. c) Patkányokat két héten keresztül szoktattunk termoneutrális környezethez (29 °C) annak érdekében, hogy csökkentsük a képességüket arra a didergéssel nem járó termogenizisre, amelyet a BAT közvetít. Az utolsó három nap folyamán az állatokat felkészítettük egy olyan készülék alkalmazására, amellyel a testbe való behatolás nélkül lehet mérni a szívverés sebességét a talppárnára szerelt elektródák segítségével. Az elektródák egy ECG- integrátorhoz voltak csatlakoztatva, amely a pulzus folyamatos leolvasását tette lehetővé. A b) kísérlet lefolytatásakor a vizsgált vegyületeket bőr alá vagy szájon keresztül adtuk be az EDso-érték meghatározásakor, és a pulzusszámot a vegyület beadagolása után 15-30 perccel mértük meg. az eljárást ezután egymást követően megismételtük egyre nagyobb többszörösét alkalmazva a b) vizsgálat során meghatározott EDso-nek; egészen addig, amíg a pulzusszám el nem érte vagy meg nem haladta a percenkénti 500-at. így ki tudtuk számítani azt a dózist, amely az 500/perc-es pulzusszám kiváltásához szükséges: D500. A b) vizsgálat során megállapított D500 és ED50 hányadosa a szelcktivitási index (Sí), amely mértéke a vizsgált vegyület BAT-ra vonatkozó szelektivitásának a szív és érrendszerre gyakorolt hatással kapcsolatban. Azokat a vegyületeket tekintettük nagymértékben szelektíveknek, amelyeknek az SI- értéke nagyobb volt egynél. A nemszelektív vegyületek Sí-értéke egy alatt maradt; az izoprenaliné például 0,06 volt. d) Patkányokat szoktattunk a hideghez 4 °C-on négy napon keresztül, hogy megnöveljük a termőgenezissel kapcsolatos képességüket. A patkányokat ezt követően meleg környezetbe (23 °C) helyeztük át két napra. A következő napon meghatároztuk az állatok alap anyagcseresebességét olyan módon, hogy egy Arundel és munkatársai által ismertetett zártkörű berendezés segítségével mértük az oxigénfogyasztást (J. Appl. Physiol. Respirat. Environ. Excersise Physiol., ÍZ- 5.1591-1593 /1984/). A patkányoknak ezután beadtunk — szájon keresztül vagy bőr alá — a vizsgált vegyületek 0,45 vegyes% nátrium-kloridot és 0,25 vegyes% Polysorbate 80-at tartalmazó vizes oldatából vagy szuszpenziójából annyit, hogy a bejuttatott hatóanyagmennyiség mintegy 10 mg/kg volt. Legalább egy órát vártunk a beadagolás után, majd meghatároztuk az anyagcsere sebességét. Ennél a vizsgálatnál azokat a vegyületeket tekintettük hatásosaknak, amelyek alkalmazásakor jelentő^ mértékben megnövekedett az anyagcsere sebessége azokhoz a kontroli-állatokhoz viszonyítva, amelyek csak vivőanyagot tartalmazó oldatot vagy szuszpenziót kaptak (Student „t vizsgálata: p,5). Az előzőekben ismertetett vizsgálatok során az (I) általános képletű vegyületek toxicitás megnyilvánulása nélkül általában a következő hatásokat 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
