200942. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dipiridamolt, illetve dipiridamolt és interferont tartalmazó, daganatok kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására
HU 200942 B s, 1 és n - HuIFN-nel és dipiridamollal végzett kezelés. A B jelű diagram a sejt-túlélési százalékokat mutatja 6 nappal a 10 egység/ml HuIFN-ot(s), -ß(l) és -”y(n), valamint a különböző koncentrációjú dipiridamol kombinációjával végzett folyamatos kezelést követően, MM-1CN sejtvonal esetében. A o jelzés jelentése: önmagában adott dipiridamollal végzett kezelés;-a 4. ábra A diagramja a sejt-túlélési százalékokat mutatja 4 nappal a 0,1 jxKl dipiridamollal és különböző mennyiségű (egységek) HuIFN-a-val végzett folyamatos kezelést követően, KT sejtek esetében. A jelzések jelentése: o- önmagában adott HuIFN-a-val végzett kezelés; 1 - HuIFN-a-val és dipiridamollal végzett kezelés. A B diagramon sejt-túlélési százalékokat láthatunk, 4 nappal a 10 egység/ml HuIFN-a-val és külöböző koncentrációjú dipiridamollal végzett, folyamatos kezelést követően. A jelzések közül: 0 - önmagában adott dipiridamollal végzett kezelés; 1 - HuIFN-a-val és dipiridamollal végzett kezelés;-az5. ábra A diagramján sejt-túlélési százalékok láthatók, 6 nappal a 0,1 p.M dipiridamollal és különböző mennyiségű (egységek) HuIFN-ß-val végzett, folyamatos kezelést követően, PLC/PRF/5 sejtek esetében. A jelzések: o- önmagában adott HuIFN-ß-val végzett kezelés; 1 - HuIFN-ß-val és dipiridamollal végzett kezelés, a B diagram sejt-túlélési százalékokat mutat, 6 nappal 10 egység/ml HuIFN-ß-val és különböző koncentrációjú dipiridamollal végzett, folyamatos kezelést követően. A jelzések jelentése: p - önmagában adott dipiridamollal végzett kezelés; 1 - HuIFN-ß-val és dipiridamollal végzett kezelés.-a 6. ábrán morfológia és sejtmegoszlás látható, 2 nappal a HuIFN-a-val és dipiridamollal végzett kezelést követően, KT sejtek esetében. A 6A kép a Kontroll; a 6B kép a 0,1 p,M dipiridamol; a 6C kép a 10 egység/ml HuIFN-a; a 6D kép a 10 egység/ml HuIFN-a és 0,1 |xM dipiridamol;- a 7. ábrán morfológiai és sejtmegoszlás látható, 6 nappal a HuIFN-ß-val és dipiridamollal végzett kezelést követően, PLC/PRF/5 sejtek esetében. A 7A kép a Kontroll; a 7B kép a 0,1 p.M dipiridamol; a 7C kép a 10 egység/ml HuIFN-ß; a 7D kép a 10 egység/ml HuIFN-ß és 0,1 |i.m dipiridamol;- a & ábra DNS-szintézis aktivitási tesztet mutat be KT sejtek esetében, savban oldhatatlan sejt-alkotórészekbe (anyagokba) történő[3H]-dezoxi-timidin inkorporációval vizsgálva, 24 órával az ezen szerekkel végzett kezelést követően. A jelzések jelentése: 0 - HuIFN-a 1 - HuIFN-a és 0,1 jjJVI dipiridamol. A sejt-proliferáció gátlási teszt során vala7 mennyi sejtvonal logaritmikusán növekvő számú sejtjeivel végeztünk leoltásokat; egy 60 mm-es Petri-csészére l-5xl04 sejt jutott (IWAKI, Japán), majd a leoltást követően 20 órával a sejteket átmostuk, és olyan tenyésztő közeggel töltöttük fel, mely HuIFN készítményeket és dipiridamolt tartalmazott, illetve nem tartalmazott. A hatóanyagokat tartalmazó, illetve nem tartalmazó közegeket minden második nap lecseréltük. A sejtek életképességét tripán-kék vitális festék kizárásos módszerrel állapítottuk meg, és hemocitométer segítségével számláltuk meg a sejteket. A túlélés százalékos arányát a következőképpen fejeztük ki: az életképes sejtek száma a vizsgálati anyagot tartalmazó Petri-csészékben (az életképes sejtek száma a kontroll Petri-csészékben) x 100%, a leírásoknak megfelelően, például Mutation Research, 106: 357-376,1982 és J. Gen. Virol., 67:651-661,1986. A DNS-szintézis aktivitásának vizsgálata során [3H] dTHD-nek savban oldhatatlan anyagokba történő felvételét állapítottuk meg, különböző szerekkel kezelt KT, illetve RSa sejtekben, a J. Gen. Virol., 67:651-661,1986. leírásának megfelelően. A mikroszkópos vizsgálatot úgy végeztük, hogy a vizsgálati Petri-csészékbe leoltott sejteket OLYMPUS IMT-2 típusú mikroszkóp segítségével figyeltük meg és fényképeztük le (100-150-szeres nagyítás). A kísérletek többségét tompított fénynél vagy sötétben végeztük. Az eredményeket több, mint két független kísérletből nyert értékek átlagaként fejeztük ki. Az MM-ICB sejteken végzett vizsgálat során azt tapasztaltuk, hogy valamely, önmagában alkalmazott szer - 10 NE/ml HuIFN-ß vagy 0,1 p,M dipiridamol - csak kismértékben gátolta a sejt-proliferációt; a sejtproliferáció jelentős gátlása volt azonban megfigyelhető abban az esetben, amikor mindkét fent említett szert együtt adagoltuk, 4 napnál hosszabb ideig (1. ábra). A kombinált kezelést követően a sejtek morfológiai szempontból károsodottnak bizonyultak, összehasonlítva az ál-HuIFN- ß-val kezelt sejtekkel, az egyes szerekkel külön-külön kezelt sejtek azonban nem sérültek (1.2. ábra). Amikor a sejteket folyamatosan kezeltük 0,1 pÁí dipiridamollal, a HuIFN-a, -ß és g- additív hatása is megfigyelhető volt (3A ábra). Magasabb koncentrációk, sőt még alacsonyabbak - egészen 0,01 p,M dipiridamol koncentrációig lefelé - is hatékonyan fokozták a HuIFN anticelluláris hatását (3B ábra). A két sejtvonal (sejtfajta) - a metasztatikus agydaganat (KT) és a hepatoma (PLC/PRF/5) sejtvonal - HuIFN-nel és dipiridamollal végzett kombinált kezelésekor azt tapasztaltuk, hogy mindkét sejtfajta igen érzékeny a szerek szinergetikus gátló hatására (4. és 5. ábra). Bár a KT sejtek szaporodását már az önmagában adott HuIFN-a is nagymértékben gátolta, a sejtszaporodás gátlása azonban az egyidejű dipiridamol-adagolás következtében fokozódott (4. ábra). Még a0,1 p,M-nál kisebb dózisú dipiridamol is - mely önmagában adagolva alig befolyásolta a KT sejtek szaporodását - képes volt a HuIFN-« gátló hatásának fokozására (4B ábra). Mindkét sejtvonal celluláris morfológiai tulajdonít 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
